Global Proteome Survey -Transforming antibody-based affinity proteomics into a global discovery platform

Abstract

Proteomics is expected to generate new insights into biological processes as well as identify novel biomarkers and therapeutic targets since most biological functions are transmitted through proteins. However, due to the complexity displayed by a proteome and inherent limitations associated with current methodologies, proteomic analyses often result in incomplete coverage and inconsistent measurements. Clearly, the development of novel high-performing proteomic platforms will be essential in order to successfully decipher the human proteome(s).



This thesis, based on four original papers denoted I to IV, describes the development and applicability of a novel proteomic technology platform entitled Global Proteome Survey (GPS) capable of transforming affinity proteomics into a global discovery engine. The GPS methodology combines the best features of affinity proteomics and mass spectrometry, and is based on using antibodies specific for short C-terminal amino acid peptide motifs shared by many proteins. This opens up the possibility to identify and quantify significant portions of a proteome, while still using a limited set of binders in a specie independent manner (Paper I-IV). Furthermore, structural models were generated for a large set of the experimentally verified captured peptides and the matching antibodies (Paper III). The data generated novel insights into antibody-peptide interactions and showed that a few key residues were essential for establishing specificity and acting as anchor residues.



The GPS assay reproducibility was extensively tested (Paper I, II, and IV) and displayed median coefficient of variations in the range of 10-20% in tissue profiling. In addition, the sensitivity was demonstrated by successfully targeting proteins present in a range of abundance values spanning over a million down to less than 50 copies per yeast cell (Paper I and II).



In Paper IV, the first clinical proteomic application of GPS was demonstrated by generating in-depth proteomic insights of 52 breast tumor tissues. While using only 9 antibodies, the GPS-platform enabled identification and quantification of over 1300 proteins, and most importantly established a link between a molecular signature and tumor progression. Highly relevant and promising cancer-associated protein signatures related to histologic grade, estrogen receptor, and HER2/neu-status were identified.



In conclusion, we have developed and demonstrated the quantitative capability, reproducibility, sensitivity, and coverage of the GPS methodology. It provides important methodological solutions to the complexity of proteome analysis and may act as a valuable tool for analyzing large numbers of clinical samples in an accurate, sensitive, and discovery-based manner. Hence, antibody-based affinity proteomics have been transformed into a global discovery platform and will pave the way for novel proteomic insights into complex molecular pathways in health and disease.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

En av de stora vetenskapliga bedrifterna hittills under 2000-talet är onekligen att man efter många års arbete för första gången lyckades kartlägga (sekvensera) samtliga mänskliga gener. Det mänskliga DNA:t är lokaliserat till cellkärnan och i princip så kan man likna en cellkärna med ett kontrollrum fyllt av manualer (DNA) som talar om cellens sammansättning och hur dess maskineri ska byggas ihop. Trots att det gått mer än 10 år sen det första humana genomet kartlades är majoriteten av genernas funktioner fortfarande okända. För att få en ökad förståelse måste parallella studier på genprodukterna dvs. proteinerna göras. Beroende på typen av inkommande signaler till cellkärnan kommer nämligen olika manualer (gener) börja läsas av vilket leder till att s.k. budbärarmolekyler (mRNA) tillverkas och dessa molekyler transporteras i sin tur ut från cellkärnan till specifika ställen i cellen där de kan uttrycka sitt budskap, dvs. budskapet kodas av, och ett specifikt protein kan bildas. Proteiner är de molekyler som aktivt utför cellens önskade order/funktioner och uppskattningsvis så finns det över 20 000 olika humana proteiner. I en mänsklig cell antar proteinerna en mängd olika former och denna enorma komplexitet ställer därmed mycket stora krav på de analysverktyg som behöver användas för att studera ett helt proteom dvs. alla protein som finns i en viss celltyp vid en viss tidpunkt. Eftersom de flesta läkemedel är riktade mot proteiner samt det faktum att många av nuvarande diagnostiska tester för en människas olika sjukdomstillstånd är baserade på protein-analyser gör sammantaget att behovet av nya metoder för heltäckande proteomanalyser är mycket stort. Nyttan av att snabbt och pålitligt kunna studera så många olika proteiner som möjligt i t.ex. ett tumörvävnadsprov eller blodprov kommer bli mycket central inom den framtida medicinska diagnostiken. Sådana proteinanalyser kommer kunna ge en betydligt mer komplett bild av den specifike individens tillstånd vilket kommer möjligöra en mer individanpassad skräddarsydd behandling dvs. val av korrekt behandling för att uppnå maximal effekt och minimalt lidande.

I min avhandling som bygger på fyra vetenskapliga arbeten beskrivs grunden, utvecklandet och de första stegen för användandet av en ny metodik för proteomanalyser. Målet var att utveckla ett analysverktyg där stora delar av proteomet skulle kunna analyseras med hjälp av s.k. affinitets-proteomik och masspektrometri. Detta i hopp om att möjliggöra enklare, snabbare, känsligare och förhoppningsvis i slutändan heltäckande analyser för att t.ex. kunna identifiera nya sjukdomsassocierade proteiner. Den utvecklade metodiken kallar vi Global Proteome Survey (GPS) och i de presenterade manuskripten visas hur metoden fungerar i sin helhet för analys av biologiska prover. Många av de tidigare discovery-analysverktygen har ofta varit begränsade till att studera proteiner som återfinns i högre koncentrationer i en cell vilket medför att man missar möjligheten att mäta betydligt ovanligare men minst lika viktiga proteiner (nålen i höstack fenomenet). För att kunna mäta låguttryckta proteiner har man ofta fått använda sig av antikroppar (bindar-molekyler) som kan fånga de aktuella proteinerna. Men detta har i sin tur gjort att man varit tvungen att bestämma sig (val av antikroppar) redan innan experimenten gjorts exakt för vilka protein man ska analysera vilket givetvis begränsat möjligheterna för att upptäcka helt nya okända sjukdomsassocierade proteiner. GPS metodiken löser detta och öppnar upp för globala analyser genom att använda sig av en unik variant av antikroppar som kan fånga korta terminala aminosyrasekvenser (motif) hos olika peptider. Dessa unika bindarmolekyler har vi döpt till CIMS-bindare (eng. Context Independent Motif Specific). Proteiner kan nämligen klippas upp i mindre fragment s.k. peptider genom att exponeras för specifika enzymer (t.ex. trypsin) som klipper alla protein i mindre beståndsdelar (peptider) vid specifika positioner. Dessa peptider kan vi sedan fånga med våra CIMS-bindare och därefter detektera och kvantifiera med hjälp av en masspektrometer dvs. ett instrument som kan mäta molekylers massa med extremt hög noggrannhet. Man börjar mäta massan för hela peptiden (intakt) och därefter även olika fragment som uppkommer från peptiden i instrumentet. Genom att tolka alla de uppkomna fragmentens massor kan man bestämma hela peptidens aminosyrasammansättning (sekvensordning) och med lite tur och i kombination med avancerade databassökningar spåra från vilket protein som peptiden ursprungligen kom ifrån. Databaserna man använder sig av för att söka i har kunnat byggas upp tack vare att det mänskliga genomet blev känt vilket visar på den stora betydelse sekvenseringen av genomet har och kommer fortsätta ha många år framöver.

För att påvisa GPS styrka i form av enkelhet, robusthet och känslighet studerades initialt protein extrakt från flera olika organismer (muslever, tarmvävnad från människa, samt jästceller) och vi kan nu med säkerhet säga att metodiken kommer att kunna fungera på i princip vilken typ av organism som helst (levande på vår planet). I början lades fokus på att studera ett enkelt system dvs. jäst som odlades i närvaro av glukos eller etanol. Tydliga skillnader för många nyckel-proteiner detekterades. Dessutom påvisades metodens analyskänslighet genom framgångsrik detektion av proteiner uppskattade till att finnas i mindre än 50 kopior per jästcell. I hopp om att kunna förfina och förbättra bindarmolekylerna och utveckla GPS metodiken ytterligare gjordes sedan studier på flera bindarmolekyler samt strukturella datamodellerings-studier av både bindarmolekyler och de fångade peptiderna. Resultatet av dessa modelleringsstudier gjorde att vi till viss del kan förklara varför vissa peptider fångades av vissa CIMS-molekyler och denna information kommer nu kunna användas för att generera nästa generation av nya CIMS-bindarmolekyler.

Slutligen så applicerades den utvecklade GPS metodiken för analys på bröstcancer tumörer. Bröstcancer är den absolut vanligaste cancertypen hos kvinnor och det är idag erkänt att det är en mycket heterogen och komplicerad cancer form. Desto tidigare diagnos ställs och val av korrekt terapi görs ökar drastiskt på chanserna för överlevnad. Tyvärr så är en del av de nuvarande traditionella metoderna otillräckliga och läkarna behöver få tillgång till nya kraftigare analysverktyg som kan vägleda dem bättre i val av diagnos och behandling. Genom att använda GPS teknologin på över 50 olika patient-tumör prover (fördelade i tre olika grupper (grader) av tumörer) kunde vi jämföra mer än 1300 olika proteiner mellan samtliga prover. Unika protein signaturer (differentiellt uttryckta proteiner) mellan den lindrigaste (grad I) samt svåraste (grad III) av tumör-typerna kunde tydligt påvisas. Proteiner med både kända och delvis okända funktioner identifierades och mycket intressanta mönster observerades och sammantaget gav detta en tydlig indikation på ett antal proteiner viktiga för tumörernas progression. Det finns en stor potential för att flera av dessa proteiner kan ev. kunna komma användas som biomarkörer och med fördjupade studier kan vissa t.o.m. kanske fungera som attraktiva målmolekyler för framtida läkemedel.

Sammanfattningsvis kan man säga att grunden och de initiala stegen för GPS metodiken och dess breda användningsområden och styrka har påvisats i denna avhandling. Utvecklandet av tekniken kommer fortsätta genom genererande av fler bindarmolekyler samt förfinade masspektrometri instrument och data analyser. Förhoppningsvis kommer denna metodik utgöra en av flera hörnstenar för både breda och fokuserade proteinanalyser under många år framåt.

• author: Olsson, Niclas
• supervisor: Christer Wingren
• opponent: Dr. Joos, Thomas, Natural and Medical Sciences Institute (NMI) at the University of Tuebingen, Reutlingen, Germany
• organization: Department of Immunotechnology; BioCARE: Biomarkers in Cancer Medicine improving Health Care, Education and Innovation
• publishing date: 2012
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Immunology in the medical area
• keywords: affinity proteomics, recombinant antibodies, Proteomics, mass spectrometry, proteome profiling, breast cancer, antibody specificity
• pages: 200 pages
• defense location: Lecture hall H 01, Health Sciences Centre, Baravägen 3, Lund University
• defense date: 2012-05-04 09:15:00
• ISBN: 978-91-7473-306-8
• language: English
• LU publication?: yes
• id: be258743-7e2f-4e1a-b45d-bbfdaaa3d645 (old id 2438189)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:47:03
• date last changed: 2019-03-13 18:28:02