Modulation of the calcium-force relationship in smooth muscle by polyamines and metabolic inhibition

Abstract

The relationship between intracellular free calcium ([Ca2+]i) and force in smooth muscle was investigated in receptor-coupled permeabilized preparations and by fluorimetry of the calcium indicator Fura 2 in intact smooth muscle. The time integral of spontaneous [Ca2+]i transients in the intact rat portal vein was decreased by cyanide and, during tonic contraction, cyanide reduced force without changing [Ca2+]i implying metabolic sensitivity of both membrane excitation and [Ca2+]i - activation of the contractile proteins. In permeabilized, receptor-coupled, smooth muscle of guinea pig ileum, the intracellular polyamines spermine and spermidine, ubiquitous cations connected to cellular growth, sensitized force to [Ca2+] at concentrations corresponding to the tissue contents and also inhibited transient contractions induced by release of calcium from intracellular stores. Spermine was found to increase phosphorylation of the regulatory 20 kDa light chains (LC20) by a mechanism involving inhibition of myosin phosphatase activity. Sensitization of force to [Ca2+] depended on this effect. Culture of intestinal smooth muscle with serum reduced responsiveness of force to extracellular Ca2+. This effect was prevented by the calcium channel blocker verapamil and mimicked by the calcium ionophore ionomycin, indicating dependence on chronically raised [Ca2+]i. Stimulated [Ca2+]i transients and calcium current density, as determined with the patch-clamp technique in isolated cells, were both significantly reduced compared to controls whereas the [Ca2+]i -force relationship was unaffected. The adenosylmethionine decarbyxylase inhibitor CGP 48664 reduced the contents of spermine and spermidine by 50 % in cultured guinea pig ileum strips. A high concentration of the inhibitor enhanced phasic spontaneous contractile activity and sensitivity to muscarinic stimulation and reduced the responsiveness of force to [Ca2+]i implying a reduced influence of endogenous polyamines on contractile activation. These results demonstrates influnces of energy- and polyamine-metabolism and Ca2+-homeostasis, on excitation-contraction coupling in smooth muscle.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Glatt muskulatur finns i mag-tarm kanalen, i blodkärl, i luftvägarna och i flera av urogenital organen och dess funktion på alla dessa platser är att förkorta sig och generera kraft. Så styrs t.ex. blodtrycket av sammandragning i artärer och vener och transporten av föda genom mag-tarm kanalen av rytmiska kontraktioner. Det är känt att koncentrationen av fritt kalcium inuti glatta muskelceller aktiverar sammandragningen. I allmänhet är korrelationen mellan intracellulärt kalcium och kraft mycket stark, men kopplingen kan variera över tiden och med typen av stimulering.



Ökningen av intracellulärt kalcium sker genom att kalcium strömmar in genom membrankanaler som styrs av membranspänningen, men även genom frisättning av kalcium från membranomslutna förråd inuti cellerna. När kalcium stiger binder det till proteinet calmodulin och tillsammans aktiverar de fosforylering av ett protein som kallas för myosinets lätta, regulatoriska, kedja. Myosin utgör tillsammans med aktin den glatta muskelcellens motor. När kemisk energi finns närvarande och myosinet är aktivt, interagerar dessa proteiner på ett sätt som gör att dragkraft uppstår.



I det första delarbetet undersöks effekten av metabol inhibition i portaven från råtta. Det har varit känt sedan länge att kärlmuskulatur från systemkretsloppet har en hög känslighet för minskat syretryck (pO2). Så minskar tonus och kraftens svarsbenägenhet för olika stimuli med sjunkande pO2. Detta skulle kunna gynna distributionen av blod till områden med hög metabol aktivitet. En omfattande funktionell kartläggning av råttans portaven har visat att man kan härma effekten av sänkt pO2 med hämmare av mitokondrie respirationen. En avgörande fråga är hur den metabola omställningen genom minskat pO2 eller hämmad mitokondrierespiration leder till minskad kraft. När portavenen aktiveras genom depolarisation så är kraftnedgången vid hämmad mitokondrie respiration inte förenad med en förändring av membranpotentialen. Däremot avtar fosforyleringen av myosinets regulatoriska kedja. Den intracellulära kalcium koncentrationen under de här betingelserna är inte reducerad. Metabol inhibition med cyanid representerar sålunda en situation då kraftens känslighet för intracellulärt kalcium är minskad.



I det andra delarbetet visar vi att en grupp av tillväxtrelaterade substanser, de sk. polyaminerna, har den motsatta effekten jämfört med respirationshämning på relationen mellan kalcium och kraft i glatt muskel där cellmembranet avlägsnats (bild 2). Vid avlägsnandet av cellmembranet från marsvinets longitudinella ileum muskulatur förloras även en betydande andel av cellens egna polyaminer och inom motsavarande tidsram minskar kraftens känsligheten för kalcium. Däremot minskar inte kalcium känsligheten i samma utsträckning om den mest aktiva av polyaminerna, spermin, tillförs för att kompensera förlusten. Det verkar därför som att cellens egna polyaminer skulle kunna påverka kopplingen mellan kalcium och kraft.



Vi fann att polyaminerna ökar fosforyleringen av myosinets regulatoriska kedjor och att manövrer som förväntas hindra fosforyleringsökningen också hindrar polyaminerna från att öka kraften vid en konstant kalcium koncentration. Slutsatsen är således att polyaminer, liksom metabol inhibition, verkar genom förändring av de regulatoriska kedjornas fosforylering. Fosforylerings ökningen visade sig bero på hämning av myosin fosfatas, det enzym som avlägsnar fosfat från myosinets lätta kedja.



För direkt belysa polyaminernas betydelse för kalciumkänsligheten etablerade vi en odlingsmodell i vilken vi kunde manipulera innehållet av polyaminer genom att hämma cellernas egen produktion. När vi undersökte hur olika odlingsbetingelser påverkar kontraktiliteten fann vi att odling med serum, som ofta används för att stimulera tillväxt, minskade kraften i jämförelse med kontroller odlade i frånvaro av serum. Dessutom fann vi att en högre extracellulär koncentration av kalcium krävdes för att mätta kraftsvaret till hälften i preparat som odlats med serum. Detta visade sig bero på nedreglering av antalet fungerande kalciumkanaler i cell membranet. Vi kunde blockera effekten av serum genom tillsats av en kalcium kanal blockerare under odling och härma den med en substans som ökar membranets permeabilitet för kalcium. Det tycks alltså vara så att den intracellulära koncentrationen av kalcium reglerar antalet fungerande kalciumkanaler. Detta kan tänkas representera en cellulär skyddsmekanism mot alltför höga koncentrationer av kalcium.



När vi behandlade med polyaminsynteshämmare valde vi att odla med serum eftersom omsättningen av polyaminer då var högre och vi kunde förvänta oss snabbare och större förändringar. Vi kunde genom att hämma polyaminsyntesen med substansen CGP 48664, som hämmar ett enzym i polyaminbildningen, reducera vävnadens innehåll av de mest aktiva polyaminerna till hälften. Detta medförde att kraftens känslighet för intracellulärt kalcium avtog vilket talar för att cellernas egna polyaminer påverkar kalciumkänsligheten. Dessutom medförde odling med CGP 48664 att preparaten uppvisade en ökad spontan kontraktil aktivitet och en något förhöjd känslighet för stimulering med muskarin receptor agonisten carbacholin.

• author: Swärd, Karl
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Paul, Richard J., University of Cincinnati, Cincinnati, Ohio, USA
• organization: Cellular Biomechanics (research group)
• publishing date: 1997
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Cell and Molecular Biology
• keywords: metabolic inhibition, polyamines, excitation-contraction coupling, smooth muscle, intracellular calcium, Physiology, Fysiologi
• pages: 37 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg Neurocentrum
• defense date: 1997-05-29 09:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMED/MEFF--09--SE
• ISBN: 91-628-2550-X
• language: English
• LU publication?: yes
• id: e4ac83e7-75e4-4bc7-a069-8ee430688f36 (old id 29294)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:41:20
• date last changed: 2018-11-21 21:00:13