On the Biosynthesis and Processing of Cathepsin G, Leukocyte Elastase, and Azurocidin ­ neutrophil granule members of a hematopoietic serine protease superfamily

Abstract

The serine proteases cathepsin G, leukocyte elastase, proteinase 3, and the inactive protease homologue azurocidin, stored in the azurophil granules of neutrophils, belong to a hematopoietic serine protease superfamily with members in mature effector cells of bone marrow origin. Promonocytic U-937 cells were used for studying the biosynthesis of cathepsin G and leukocyte elastase by biosynthetic radiolabelling. The proteases were found to be synthesized as precursor forms that were subjected to processing, including acquisition of N-linked complex oligosaccharides. Targeting to a granule compartment was also demonstrated. Using brefeldin A, monensin, and ammonium chloride, the subcellular localization of distinct processing events was characterized. To make possible an evaluation of the importance of distinct protein motifs, a transfectable cellular model for studying the processing was established. cDNA encoding human cathepsin G was transfected to the rat RBL cell line, after which the model was proven valid by characterizing the activation, processing, and sorting of cathepsin G. Mutant cDNAs encoding cathepsin G and leukocyte elastase lacking carboxyl-terminal peptide extensions, normally removed during processing, were transfected to RBL cells. The mutant proteins were found to be activated and sorted to granules, approximately as efficiently as the wild type proteins, hence ruling out a critical role of the propeptides for folding, stability or molecular targeting. The granule thiol protease dipeptidyl peptidase I (DPP I) has been suggested as responsible for the activation of all hematopoietic serine proteases. It was, however, not possible to activate procathepsin G, expressed in COS-7 cells, neither by co-transfection of rat DPP I cDNA nor by in vitro incubation with purified bovine DPP I. After transfection to RBL cells, a novel amino-terminal processing pattern distinct from that of other granule serine proteases was demonstrated for the synthesis and processing of azurocidin.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Som skydd mot infektioner och andra omgivningshot har högre organismer utvecklat olika försvarssystem, där det mest betydelsefulla brukar sammanfattas under begreppet immunsystem. I detta ingår olika typer av specialiserade celler med ursprung i kroppens blodbildande organ, benmärgen. Den av immunsystemets olika celltyper som är viktigast för att skydda mot bakterieinfektioner är en typ av vit blodkropp, som benämns neutrofil granulocyt. Namnet härrör från att den innehåller små färgbara korn, s k granula, vilka kan urskiljas när celler i färgade blodutstryk studeras i ljusmikroskop. De neutrofila granulocyterna är livsnödvändiga för att skydda mot allvarliga infektioner, vilket bl a framgår av att uttalad brist på dessa celler, exempelvis efter intensiv cytostatika-behandling, nästan regelmässigt leder till potentiellt livshotande infektioner. För att fullgöra denna uppgift innehåller cellernas granula olika proteiner med bakteriedödande egenskaper. Cathepsin G, leukocyt elastas och azurocidin, de proteiner som studerats i denna avhandling, utgör sådana proteiner.



Förutom att vara bakteriedödande är cathepsin G och leukocyt elastas s k proteaser, d v s de är enzymer med förmåga att bryta ned andra proteiner. Under okontrollerade betingelser, exempelvis vid allvarliga inflammatoriska tillstånd, kan de orsaka ogynnsam vävnadsnedbrytning. Azurocidin, däremot, har till följd av mutationer förlorat denna egenskap, men har jämte bakteriedödande förmåga andra viktiga funktioner vid inflammation. Dessa besläktade proteiner tillhör en större enzymfamilj, i vilken samtliga medlemmar lagras som aktiva enzymer, med viktiga funktioner för olika celler inom immunsystemet. Detta förhållande är unikt för denna proteasfamilj, eftersom proteaser i regel lagras i inaktiv form.



I de arbeten som ingår i min avhandling har vi i olika experimentella system studerat hur dessa granulocytproteiner bildas, och hur de bearbetas (processas) och transporteras i cellerna för att lagras som aktiva proteiner. Bland de grundläggande metoderna för våra studier har ingått s k biosyntetisk inmärkning, d v s då radioaktiva aminosyror "byggs in" i proteiner när dessa bildas från enskilda aminosyror. De studerade proteinerna har sedan isolerats med specifika antikroppar som känner igen ett visst protein. Efter separation med elektrofores, har därefter de inmärkta proteinerna ifråga identifierats med hjälp av autoradiografi, d v s när radioaktiviteten i proteinerna ger upphov till svärtning av strålningskänslig film. Om deras molekylvikter skiljer sig, kan olika processningsformer av ett protein urskiljas med dessa metoder.



För att karakterisera bildningen av ett protein krävs tillgång till celler i vilka proteinet bildas i tillräcklig omfattning. De proteiner vi studerat bildas normalt i celler som utgör ett tidigt förstadium till neutrofila granulocyter. Dessa celler utgör vanligen endast en bråkdel av totalantalet celler i benmärgen. För att ha obegränsad tillgång till celler i vilka de studerade proteinerna bildas, har vi istället valt att använda s k immortaliserade cell-linjer, i detta fall celler av leukemi-ursprung som kan odlas för mycket lång tid ("gjorts odödliga") och även förökas till stort antal. Med hjälp av en sådan cell-linje har vi visat hur cathepsin G och leukocyt elastas initialt bildas som förstadier (proformer) till de mogna proteinerna. När proformerna processas, adderas sockerstrukturer till proteinkedjan och delar av den ursprungliga proteinkedjan avspjälkas. Vi har även kartlagt var i cellen de olika processningsstegen sker.



Från genetisk information kan det förutsägas vilka delar av den ursprungliga proteinkedjan som kommer att avlägsnas vid processning till det mogna proteinet. Två olika delar, s k propeptider, avspjälkas från proformerna av cathepsin G och leukocyt elastas; dels i ena änden en mindre enhet bestående av endast två aminosyror (en dipeptid), och dels en längre aminosyrasekvens i den andra änden av proteinet. Det har visats att avklyvning av dipeptiden är nödvändig för aktivering av dessa enzymer. Den andra propeptidens funktion har däremot ej varit känd. Vi har utvecklat en experimentell strategi för att kunna undersöka detta, och även besvara likartade frågeställningar. Med molekylärbiologisk teknik kan genetisk information kodande för proteiner, s k cDNA, överföras till celler där proteinerna normalt ej bildas. Man kan även förändra det genetiska materialet genom att införa olika mutationer och studera effekterna av detta. Vi har visat att medlemmar av den studerade enzymfamiljen bildas och ger upphov till aktiva enzymer vid överföring, transfektion, av cDNA till leukemiska cell-linjer med ursprung från råtta eller mus. Således har dessa celler det enzymatiska maskineri som behövs för korrekt processning av dessa proteiner från människa. Genom att avlägsna de delar som kodar för de tidigare omnämnda propeptiderna, har vi studerat deras betydelse. De muterade proteinerna bildades, aktiverades och lagrades på motsvarande sätt som de icke-muterade proteinerna. Vi har därför dragit slutsatsen att propeptiderna ej innehåller information, som är nödvändig för molekylstabilitet eller sortering till "rätt adress" i cellerna.



I min avhandling presenteras även resultat som visar att processningen av azurocidin skiljer sig från processning av övriga besläktade proteaser, genom att vid aktivering klyvs sju aminosyror av i en stegvis process, istället för endast avspjälkning av en typisk dipeptid. Enzymet dipeptidyl peptidas I har föreslagits vara ansvarigt för aktivering av alla medlemmar i denna proteasfamilj. Våra resultat från försök att aktivera cathepsin G med detta enzym, talar emellertid för att andra aktiveringsenzymer återstår att identifiera.



Sammanfattningsvis har resultaten i min avhandling bidragit till att öka kunskapen om bildning och aktivering av de studerade proteinerna. Då dessa har funktioner som är viktiga för kroppens normala försvar mot infektioner, samtidigt som de även kan utöva negativa effekter vid inflammatoriska tillstånd, är ingående kunskap om deras bildning och aktivering betydelsefull. Detta kan bidra till att man i framtiden kan utveckla strategier, exempelvis nya läkemedel, för att kunna modulera dessa proteiners verkan eller kopiera deras gynnsamma effekter på ett för individen fördelaktigt sätt.

• author: Lindmark, Anders
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Borregaard, Niels, Granulocyte Research Laboratory, DK-2100 Copenhagen, Denmark
• organization: Division of Hematology and Transfusion Medicine
• publishing date: 1997
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Hematology
• keywords: extracellular fluids, Haematology, sorting, Activation, propeptide, Hematologi, extracellulära vätskor
• pages: 89 pages
• defense location: 13 September 1997
• defense date: 1997-09-13 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MEMA--1048--SE
• ISBN: 91-628-2621-2
• language: English
• LU publication?: yes
• id: f5705e1d-3593-4838-8cc1-6b486b83a82a (old id 29446)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:08:06
• date last changed: 2018-11-21 21:09:11