Mitochondrial function in sepsis - Temporal evolvement of respiratory capacity in human blood cells

Abstract

Sepsis is a devastating disease that is caused by the host’s response to an overwhelming infectious process. As sepsis progresses, organs distant from the site of infection become affected and sepsis-induced multiple organ failure ensues. An impaired immunologic response, including dysfunctional peripheral blood immune cells has been described as part of the septic syndrome. Mitochondrial dysfunction has been suggested to be a contributing factor in the pathogenesis of these alterations and restoration of mitochondrial function has been implicated as a prerequisite for the recovery from sepsis. Further, platelets have been proposed to serve as a surrogate tissue in evaluation of systemic mitochondrial dysfunction. The overall aim of this thesis was to evaluate the temporal evolution of mitochondrial respiratory function in platelets and peripheral immune cells during the course of sepsis.

In the first study we established methodology and performed a thorough assessment of normal human platelet respiratory function ex vivo from healthy individuals in a wide age-span using high-resolution respirometry. We concluded that freshly isolated platelets, intact or permeabilised, were well suited for studying human mitochondria ex vivo. With different titration protocols, detailed information of the cellular respiratory capacities could be obtained and we deemed this approach suitable for evaluating endogenous mitochondrial capacity as well as alterations of mitochondrial function induced by exogenous factors.

In the two subsequent studies we examined mitochondrial respiratory function in platelets and peripheral blood immune cells (PBICs) of patients with severe sepsis or septic shock and studied its evolvement during the first week following admission to the intensive care unit. In both cell types we found that mitochondrial respiration (per cell) gradually increased during the week analysed. In platelets, this increase was higher in patients who subsequently died. Also, in platelets, we observed reduced respiratory control ratios of intact platelets when the cells where suspended in the patient’s own plasma. As markers for mitochondrial content we measured mitochondrial DNA (mtDNA), cytochrome c (Cyt c) and citrate synthase (CS). There was a difference between the two cell types in that the markers were profoundly more increased in PBICs compared to platelets even though they displayed approximately the same levels of increase in mitochondrial respiration.

In the final study of this thesis we evaluated cytokines and nitric oxide in the plasma from the septic patient cohort since these signaling molecules have been demonstrated to enhance mitochondrial respiration through stimulation of mitochondrial biogenesis. Of ten different cytokines and NO analysed, IL-8 levels correlated positively with both maximal ATP-generating as well as maximal non-ATP-generating rates of respiration in samples from the latest time point evaluated. Further, the plasma level of IL-8 was higher in non-survivors in samples taken at day 6-7 compared to survivors.

In conclusion, this thesis demonstrates that circulating blood cells exhibit increased respiratory capacities throughout the first week of sepsis. This increase seems to be accomplished by different mechanisms; in PBICs by increased mitochondrial mass as indicated by elevated levels of mitochondrial markers, and in platelets possibly by a post-translational regulation of mitochondrial respiratory capacity. In addition, a plasma factor seems to be able to induce increased uncoupling of respiration in platelets during sepsis.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Allt liv på jorden är beroende av energi. Växter och vissa bakterier kan fånga och utnyttja solens energi för att bygga upp sina celler och dess delkomponenter som fetter, sockerarter och proteiner. Den energi som på så sätt blir bunden i dessa molekyler kan användas av djur och människor genom att vi konsumerar dem. För att energin skall kunna utnyttjas av kroppen måste den frigöras och konverteras till en för cellerna användbar energikälla och denna omvandling sker till största delen i mitokondrierna. Mitokondrier finns i alla kroppens celler undantaget några få speciella typer, exempelvis röda blodkroppar. Det har föreslagits att det ursprungligen var bakterier som för många miljoner år sedan började leva i ett samspel med celler, som inte kunde producera sin egen energi, och att bakterierna därefter utveckats till de mitokondrier som nu finns i cellerna i kroppen. Stora sockermolekyler som stärkelse i till exempel potatis bryts ned till mindre molekyler som upptas av tarmen och transporteras till cellerna. Här fortsätter nedbrytningen med den så kallade glykolysen genom att sockermolekylen glukos delas och bryts ned till pyruvat. Pyruvat transporteras till mitokondrien där den ingår i den så kallade citronsyracykeln där ytterligare nedbrytning sker. Under denna process frigörs elektroner och protoner som överförs till två bärarmolekyler. De kan sedan avge elektronerna till andningskedjan som är en serie proteiner som transporterar elektronerna mellan sig för att till slut avge dem till en syrgasatom som då omvandlas till vatten. När elektronerna vandrar mellan proteinkomplexen frigörs energi som används till att pumpa ut protoner eller vätejoner till mellanrummet mellan mitokondriens två membran. På så sätt byggs en gradient upp mellan det inre av mitokondrien med låg koncentration av protoner och membran-mellanrummet med hög koncentration. Då alla atomer strävar efter att vara jämnt fördelade uppstår en kraft som utnyttjas av det femte komplexet i andningskedjan. Här kan protonerna komma tillbaka till insidan av mitokondrien och när de passerar genom detta komplex används kraften till att sammanfoga en ADP-molekyl med en fosfat-molekyl för att bilda ATP. Denna kan sedan transporteras runt i cellen för att användas som kroppens ”batteri” vid energikrävande processer. Om det uppstår fel i mitokondrien kan det leda till energibrist i cellen. Detta påverkar i sin tur cellens olika funktioner som inte kan upprätthållas och som yttersta konsekvens kan energibristen leda till celldöd.

Sepsis brukar i vardagligt tal kallas för blodförgiftning. När en bakterie bryter igenom kroppens normala försvar startar en infektion. Kroppen börjar bekämpa denna infektion med hjälp av immunförsvaret samtidigt som den försöker hindra den från att sprida sig vidare. Om bakterierna är för många eller om kroppens immunförsvar fungerar dåligt kan dock infektionen tränga igenom försvarsmekanismerna och sprida sig till hela kroppen. Vid sepsis är det egentligen inte bakterierna som sådana som orsakar den mesta skadan (även om de orsakar viss skada) utan det är det kraftfulla immunförsvaret som bär det största ansvaret. När infektionen blivit generell och övergått i sepsis blir de flesta av kroppens organ påverkade med en försämrad funktion som resultat. Patienter blir förvirrade och får sänkt medvetande för att hjärnan är påverkad, får lågt blodtryck pga. att hjärtat pumpar sämre och att kärlen inte kan hålla samman, urinproduktionen går ned pga. njurpåverkan etc. Om infektionen behandlas och patienten får det stöd som behövs kan kroppen återhämta sig och organen återfå sin funktion. Orsaken till att organen slutar att fungera är inte klarlagd men en hypotes är att mitokondrierna blir påverkade vid sepsis i en sådan grad att det uppstår energibrist i cellen som då inte kan utföra sina normala funktioner vilket får till konsekvens att organen slutar fungera. Energibristen är dock inte så grav att cellen eller organen dör då de efter hand bevisligen kan återhämta sig igen.

I de studier som ingår i den här avhandlingen har vi studerat mitokondriefunktionen hos patienter med sepsis och hos friska kontroller.

Ett problem när man skall studera mitokondrier vid sepsis är att man helst av allt skulle vilja undersöka dem i de organ som är mest påverkade vilket oftast skulle betyda hjärna, hjärta, lungor och njurar. På grund av de risker som finns med att ta ut provmaterial s.k. biopsier från dessa organ är detta inte möjligt och man får då istället använda andra vävnader. Tidigare studier har mest använt sig av muskelbiopsier. Vi har istället fokuserat på de mitokondrieinnehållande celler som cirkulerar i blodet dvs. trombocyter och vita blodkroppar.

I den första studien satte vi upp en metod för att analysera mitokondriefunktionen i trombocyter och undersökte hur den normala funktionen ser ut i olika åldergrupper, skillnader mellan kön samt hur länge vi kunde spara blodet utan att resultaten försämrades. Vi undersökte dels blod från navelsträng hos nyfödda, dels vanliga blodprover från barn samt från vuxna i både Sverige och Japan. I våra resultat kunde vi se att analysmetoden var mycket stabil mellan de olika grupperna och att vi kunde spara blodet i ca 24 timmar utan att det påverkade resultaten påtagligt.

I den andra studien tog vi blodprover från patienter med sepsis och jämförde resultaten från friska frivilliga personer. Blodproverna togs tre gånger under den första veckan som patienterna var inlagda på intensivvårdsavdelningen (IVA). Vi undersökte trombocyterna i patienternas egen plasma och i en vanlig buffertlösning och såg då att mitokondrierna som analyserades i plasman mådde sämre då de hade ett ökat läckage av protoner i sitt innermembran. Samtidigt såg vi att mitokondriernas funktion ökade successivt under veckan som gick så att de vid sista provtillfället fungerade nästan dubbelt så bra jämfört med kontrollerna. Ett annat fynd var att de patienter vars mitokondriefunktion ökade mest hade en högre dödlighet tre månader efter att de hade varit inlagda på IVA.

I den tredje studien gick vi vidare från trombocyter till vita blodkroppar. Dessa celler har en central roll i immunförsvaret och är aktiverade för att bekämpa infektionen i sepsis. I flera studier har man konstaterat att längre fram i det septiska förloppet klarar de inte av att upprätthålla sin normala funktion och man har även här misstankar om att mitokondrierna kan vara involverade. Vi utgick från samma protokoll och tog prover från nya patienter med sepsis och isolerade fram de vita blodkropparna från blodet och undersökte mitokondriefunktionen. Liksom hos trombocyter fann vi att funktionen ökade under veckan som gick och tolkade det som tecken på stimulering av mitokondriell biogenes (ökad funktion eller mängd mitokondrier). Resultaten styrktes också genom att vi mätte tre olika mått på mitokondriemängd som alla ökade under analysperioden. Till skillnad från trombocyterna hittade vi inte något ökat läckage för protoner över innermembranet i vita blodkroppar från septiska patienter.

Att mitokondriers mängd och/eller funktion ökar kallas biogenes. Flera faktorer som produceras och frigörs vid sepsis kan potentiellt hämma mitokondriefunktionen samt även inducera mitokondriell biogenes. I den sista studien mätte vi nivåerna av ett utvalt antal av dessa signalämnen s.k. cytokiner samt indirekt även nivån av en gas, kväveoxid (NO) i plasman från de septiska patienterna. Vår hypotes var att nivåerna i blodet skulle korrelera med den mitokondriella respirationen så att de som hade högst nivå av cytokiner eller NO också var de som ökade mest i sin respiration. En av cytokinerna, IL-8 visade sig samvariera med mitokondriefunktionen i de prover som var tagna under de sista dagarna i den veckan vi undersökte patienterna. Det är således möjligt att IL-8 kan vara med i regleringen av mitokondriens ökade funktion i sepsis men fler studier är nödvändiga för att bekräfta detta.

Sammanfattningsvis så har vi sett att initialt i sepsisförloppet verkar det finnas en viss negativ påverkan på mitokondriefunktionen i trombocyter genom ett ökat läckage över innermembranet samtidigt som det sker en stimulering av mitokondrierna att öka sin funktion. Denna stimulering av mitokondriefunktionen fann vi även i vita blodkroppar där vi däremot inte kunde se några tecken till försämrad funktion vare sig tidigt eller sent i förloppet. Nivån av endast en av tio undersökta cytokiner i blodet samvarierade med mitokondriell funktion och även om flera av dessa ämnen har kapacitet att stimulera till ökad mitokondriefunktion är regleringen uppenbarligen mer komplex än ett direkt samband.

Trombocyter har visat sig fungera utmärkt för att bestämma mitokondriefunktion i sepsis och vi tror att tekniken kommer att visa sig användbar vid studier av ett antal andra sjukdomar och tillstånd.

• author: Sjövall, Fredrik
• supervisor: Eskil Elmer; Hans Friberg; Magnus Hansson
• opponent: Professor Singer, Mervyn, Bloomsbury Institute of Intensive Care Medicine, University College London, United Kingdom
• organization: Department of Clinical Sciences, Lund; Mitochondrial Pathophysiology Unit-lup-obsolete (research group)
• publishing date: 2013
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medical and Health Sciences; Other Clinical Medicine
• keywords: human, sepsis, severe sepsis, septic shock, platelets, mitochondria, OXPHOS, high-resolution respirometry, mitochondrial disorders, multiple organ failure, biogenesis, leukocytes, cytokines, respirometry, oxygen consumption, blood cells, temporal
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2013:44
• pages: 83 pages
• defense location: Belfragesalen, Biomedicinskt Centrum, D15
• defense date: 2013-05-24 09:30:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-87449-14-7
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 131d0eca-ce4e-47fc-aa6c-1bae551928a8 (old id 3732329)
• date added to LUP: 2016-04-01 14:51:05
• date last changed: 2023-04-18 20:05:52