Hormone-sensitive lipase: Molecular analyses of the human gene; structural and evolutionary aspects on expression, alternative splicing and cold adaptation

Abstract

Hormone-sensitive lipase (HSL) is a key enzyme in adipose tissue that hydrolyses stored fat (triacylglycerol). The activity of HSL is under strict hormonal and neural control. Lipolytic agents, such as catecholamines, increase the cAMP levels, resulting in an activation of cAMP-dependent protein kinase (PKA), which in turn phosphorylates and activates HSL. This thesis describes the structural organisation of the human gene, the human and garden dormouse HSL cDNA sequence and the primary characterisation of the promoter directing HSL expression in human white adipose tissue. The HSL locus, positioned on the long arm of chromosome 19 (19q13.13), was shown not to be duplicated to the short arm, as previously suggested. The human HSL gene consists of nine coding exons (exons 1 to 9) spanning 11 kb, which are common for all human HSL transcripts studied to date. Moreover, there are four known distinct 5' exons (T1, T2, A and B, located 16, 12,5, 13, and 1,5 kb upstream exon 1), which are used in a mutually exclusive manner. The expression of the HSL gene is regulated in a complex tissue- and, most likely, species-specific manner. In human testis mRNA both T1 and T2 are present, whereas in human white adipose tissue HSL expression is directed from the promoter upstream of exon B. Both exon A and B are found in HSL mRNA from white adipocytes in garden dormouse (<i>Eliomys quercinus sp.</i>), indicating a species difference compared to human adipocytes. Curiously, garden dormouse HSL is more similar to human than to rat and mouse HSL. Phylogenetic analyses of all four sequences support this relationship, suggesting paraphylism among rodents. Up to 40% of human HSL lacks exon 6, due to a species-specific, in-frame exon skipping during the pre-mRNA splicing. The skipping occurs because of species differences in the sequences within and just downstream exon 6. The truncated mRNA is translated and the protein product (HSL-S) is, as expected, devoid of both lipase and esterase activities, due to lack of the catalytic site serine. However, the phosphorylation sites, encoded by exon 8, appear to be exposed, since HSL-S acts as substrate for PKA. HSL displays a high catalytic activity at low temperatures. A loop structure located close to the active site contains a stack of glycine residues. The contribution of these residues to the cold adaptation property of HSL was investigated through site-directed mutagenesis. It was concluded that the multiple glycine residues in this loop are important for enzyme function but are not alone responsible for rendering HSL cold adapted.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Allmän Introduktion Hormonkänsligt lipas (HKL/HSL) är det protein (enzym) som hydrolyserar (bryter ner) det fett som finns lagrat inne i fettcellerna i fettväven. HSL finns också i steroidproducerande vävnader, som t.ex. binjure, äggstockar, moderkaka och testikel, och har troligtvis en viktig funktion i steroidsyntesen i åtminstone vissa av dessa vävnader. Det är dock för närvarande oklart vilken roll HSL har i testis, eftersom enzymet inte återfinns i de steroidproducerande cellerna. Genom hydrolys av triglycerider i fettcellen (adipocyten) frigörs fettsyror, som lämnar cellen och via blodbanan transporteras till olika vävnader som är i behov av energi (framför allt hjärta och (skelett)muskulatur). HSL proteinets aktivitet regleras genom en kemisk modifikation av enzymet, i form av små fosfatgrupper som fästs till vissa specifika aminosyror i proteinet. Graden av denna fosforylering bestäms till stor del av faktorer utanför cellen. Signalsubstanser (hormonella eller nervösa), t.ex. adrenalin, noradrenalin och glukagon, binder in till specifika receptorer (mottagare) på cellytan, som vidarebefordrar den utifrån kommande signalen till cellens inre. Den kaskad av reaktioner som följer leder bl.a. till en fosforylering och aktivering av HSL. De signalsubstanser, som nämnts ovan utsöndras vid t.ex. stress, fysiskt arbete och hunger. De rapporterar till fettcellen att det i kroppen finns ett generellt behov av energi. Insulin har en motsatt effekt, vilket leder till en minskad fosforylering av HSL, vars aktivitet därigenom tillfälligt stängs av. Insulin utsöndras efter en måltid, i samband med att glukoshalten i blodet ökar. Insulinsignalen till fettcellen blir i korthet: "Tag upp glukos och sluta med att bryta ner fett". En brist i denna kommunikation ger ofta upphov till insulin-resistens i "åldersdiabetes" (typ 2 diabetes). Denna avhandling behandlar främst molekylärbiologiska aspekter av HSL. Begreppet molekylärbiologi omfattar vanligtvis de biologiska förlopp som inträffar före (och t.o.m.) produktionen av proteiner. Nukleinsyror (DNA och RNA) innehar centrala roller inom molekylärbiologin. DNA och RNA är uppbyggda av 4 "baser", vardera: A, C, G, T (adenin, cytosin, guanin samt tymidin) i DNA. I RNA återfinns A, C och G men U (uracil) istället för T. DNA är dubbelsträngat, RNA är enkelsträngat. DNAt i cellkärnan bär på den genetiska informationen i form av gener. Den dubbelsträngade DNA molekylen kan bestå av flera hundra miljoner baser. Dessa stora DNA-molekyler återfinns i cellkärnans kromosomer. Människan har 23 par kromosomer (dvs 46 st.) i varje cell, utom i könscellerna som har 23 st. Varje kromosom innehåller flera hundra gener. Den information som finns lagrad i generna "översätts" till rörliga budbärar RNA (=mRNA för "messenger"RNA) molekyler som sedan förmedlar informationen till proteinproducerande enheter i cytoplasman utanför cellkärnan. Gener i flercelliga organismer kan delas upp i tre olika typer av DNA: 1) Promotorn, till vilken proteiner binder som hjälper till att producera mRNAt. Promotorn ligger framför eller "uppströms" den resterande delen av genen och styr till stor del "genuttrycket" (dvs avläsningen av nedströms liggande exoner och introner). 2) Exoner är de delar av en gen som innehåller (eller 2kodar2 för) den information som utgör mallen för proteinsyntesen. Sekvensen (kombinationen av baser) i exonerna är identiskt med sekvensen i mRNAt (med undantag för "T" (tymidin) som i mRNAt representeras i form av "U"). 3) Introner är de genfragment som ligger mellan exonerna i DNAt. Sekvensen i intronerna finns inte representerad i det färdiga mRNAt, utan klyvs bort från den primära budbärarsekvensen (pre-mRNA) innan mRNA molekylen lämnar cellkärnan. Denna process kallas för "pre-mRNA splicing". För att en pre-mRNA molekyl skall bildas måste genen läsas av. Detta sker som antytts genom att ett komplex av proteiner, var och en med en specifik funktion, binder in till promotorn och därefter förflyttar sig "nedströms", varvid DNA sekvensen börjar "läsas av" med start i det första exonet samtidigt som pre-mRNA syntetiseras.



Resultat och Diskussion Syftet med denna studie var att lägga grunden till en ökad förståelse för vilka faktorer som bestämmer när, var och hur HSL uttrycks. Ett viktigt steg var således isoleringen och karaktäriseringen av HSL genen hos människa. Den humana genen har tidigare visats vara belägen på den långa armen på kromosom 19. Vi har visat att det inte finns en annan kopia av HSL genen inom ett specifikt område på den korta armen av kromosom 19, vilket tidigare har föreslagits (av en annan forskargrupp). Den humana HSL-genen spänner över åtminstone 27.000 baser (27 kilobaser (kb)). Dock är den större delen bestående av intronsekvens. Den processade ("splicade") mRNA molekylen är mellan 2,8 och 3,9 kb lång. Det finns minst 13 exoner i genen. Nio av dessa används både i fettväv och i testikel (och förmodligen i alla vävnader som uttrycker HSL) eftersom de "kodar" för proteinet. Dessa nio exoner ligger fördelade över 11 kb. De fyra övriga exonerna, som delvis karaktäriserats i detta avhandlingsarbete, ligger alla uppströms de nio gemensamma exonerna och finns bara representerade en och en i varje HSL mRNA molekyl. Dock kan två typer av HSL mRNA förekomma i samma vävnad. Som exempel, i human testikel finns HSL mRNA i två storlekar (2,9 och 3,9 kb), vilket beror på att två promotorer samtidigt är aktiva i vävnaden. Från dessa promotorer styrs uttrycket av två olika "första exoner" (exon T1 och T2). T1 är 1 kb större än T2 och är dessutom delvis "kodande", vilket innebär att det i testikel finns ett större HSL protein. Det är okänt varför just testikel uttrycker denna större form. En metod har satts upp för att producera och rena detta protein i stor skala, vilket är av värde för vidare studier. I human fettväv är det dock endast en promotor som är aktiv. Denna styr uttrycket av exon B. I analogi med T1 och T2 i testikel, innebär detta att HSL mRNA i human fettväv består av exon B plus exon 1-9. Eftersom exon B är mycket litet (47 baser) innebär det att HSL mRNA i fettväv är 2,8 kb långt. Vi har visat att promotorn uppströms exon B är funktionell. Detta har gjorts genom att promotorn eller delar av densamma har placerats framför en gen som normalt inte uttrycks i däggdjursceller. Dessa 2konstruktioner2 har därefter förts in i celler som sedermera har analyserats för förekomst av det 2främmande2 proteinet. Ju bättre promotorn fungerar, desto mer uttrycks (bildas av) proteinet. De "uppströms" liggande exoner som hittills nämnts (exon T1, T2 och B) är placerade 16, 12,5 respektive 1,5 kb från exon 1. Ytterligare ett "51-exon", exon A, har identifierats i den humana genen. Exon A uttrycks i mycket ringa utsträckning i fettceller, men i högre grad i en cell-linje (HT29) som ursprungligen härstammar från tjocktarmsvävnad. HSLs funktion i dessa celler är för närvarande oklar. Det är dock klart att det förekommer skillnader i regleringen av HSL genen mellan de tre cell/vävnadstyperna som nämnts: testikel, fettväv och HT29. Utnyttjandet av olika promotorer möjliggör en finreglering av uttrycket av HSL genen i de olika vävnaderna. Dessutom finns det resultat som tyder på att det förekommer skillnader i utnyttjandet av promotorer inom en och samma vävnad från olika (djur)arter. Vad beträffar splicingen (bearbetningen) av HSL pre-mRNAt föreligger också skillnader mellan olika arter. Vi har påvisat att då intronerna avlägsnas från HSL pre-mRNA molekylerna i humana fettceller så känns i vissa fall inte exon 6 igen. Detta får till följd att exonet avlägsnas tillsammans med intronerna, vilket resulterar i att ett mindre protein bildas, som saknar all enzymatisk aktivitet, eftersom en vital del av proteinet 2kodas2 av exon 6. Vi har genom vidare studier visat att denna 2alternativa splicing2 endast förekommer hos människa, och inte hos mus, råtta, kanin, hund eller trädgårdssovmus. Vi vet dessutom att denna miss i igenkänningen av exon 6 till stor del styrs av själva DNA sekvensen i och strax nedanför exonet i den humana genen. Dock har vi noterat att det förekommer variationer i förekomsten av den kortare formen. För närvarande är funktionen - om det överhuvudtaget har någon funktion - för detta protein inte känd. Hastigheten varmed fettsyror frigörs i cellen beror till stor del på tillgången och funktionen av HSL. Om den totala mängden HSL inte ökar som en konsekvens av en ökad förekomst av den kortare inaktiva formen (HSL-S), så kan mängden HSL-S eventuellt utgöra en begränsande faktor i effektiviteten av den totala HSL aktiviteten. Det är värt att notera att det kortare proteinet är fosforyleringsbart. Vi har observerat att HSL innehar en unik egenskap (i jämförelse med vissa andra däggdjurslipaser), nämligen förmågan att fungera vid lägre temperaturer. Under vintern sänker hibernerande (övervintrande) gnagare sin kroppstemperatur till samma nivå som omgivningen, vilket ofta är omkring 6°C (i sällsynta fall under 0°C!). Detta möjliggörs genom en markant sänkning i aktiviteten av alla biokemiska reaktioner (metabolismen). Det krävs dock en jämn tillförsel av energi för att underhålla den basala metabolismen. För att klara dessa extrema förhållanden måste enzymerna som ombesörjer de mest vitala processerna vara väl anpassade i växelvarma djur. Under vinterperioden, lever djur som hibernerar till stor del på det fett de lagrat under sommaren och hösten. För att förse kroppen med energi krävs att HSL fungerar vid dessa låga kroppstemperaturer. Tillika behövs ett effektivt lipas vid uppvaknandet från dvalan, eftersom kroppstemperaturen då snabbt måste öka till 37°C. Denna värmealstrande process kräver mycket energi i form av fett som förbränns i brun fettväv, där ett protein (termogenin/UCP) bildar värme istället för att binda energin i andra molekyler. I närheten av det katalytiska sätet i HSL proteinet, (dvs den plats där hydrolysen sker) finns en ögle- eller loop-struktur som innehåller flera små aminosyror. Mutationer i denna loop-region påverkade inte HSLs köldanpassningsegenskap. Däremot påverkades enzymaktiviteten mycket påtagligt av alla mutationer som introducerades i denna region. Det innebär att strukturen i den studerade loopen är optimerad i det naturligt förekommande enzymet och att den är av betydelse för enzymets funktion. Under denna studie observerades skillnader i rått HSL-proteinets förmåga att fungera bättre vid lägre temperaturer än 37°C (>16°C), då det jämfördes med HSL-proteinet från människa. Eftersom detta kunde spegla evolutionära skillnader mellan de två arterna, beslöt vi att studera HSL från en hibernerande gnagare. HSL cDNA (DNA-likt mRNA) från trädgårdssovmusen (Eliomys quercinus) har således isolerats ("klonats") och dess sekvens bestämts. Vi fann till vår förvåning att trädgårdsmus HSL liknar det mänskliga enzymet mer än rått HSL, både vad beträffar graden av köldanpassning och själva sekvensen. Dock visade sig alla tre enzymerna vara lika aktiva vid temperaturer under 16°C (20% av 37°C-aktiviteten vid 3°C, vilket är ovanligt mycket för ett däggdjursenzym). En mer grundlig jämförelse av DNA och protein sekvenserna av HSL från de fyra arterna (människa, råtta , mus och trädgårdssovmus) stödjer hypotesen om att gnagare inte fylogenetiskt består av en stor "familj" (eller korrekt uttryck "ordning"), utan snarare att rått-liknande gnagare och sovmössen separerade evolutionärt vid en tidpunkt som föregick den tidpunkt då människa och sovmössen separerade. Liknande resultat har på likartade grunder nyligen publicerats vad beträffar den fylogenetiska placeringen av marsvin (guinea-pig).

• author: Laurell, Henrik
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Doc Enerbäck, Sven, Göteborg University
• organization: Department of Experimental Medical Science
• publishing date: 1998
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Basic Medicine
• keywords: enzymologi, Proteiner, Proteins, enzymology
• pages: 160 pages
• defense location: Lecture hall A
• defense date: 1998-03-06 13:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MECM--97/1006--SE
• ISBN: 91-628-2823-1
• language: English
• LU publication?: yes
• id: f979dfa6-5c32-4f06-b9ab-a6ce507a302f (old id 38397)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:41:53
• date last changed: 2018-11-21 21:00:16