Ischemic and Hypoglycemic Brain Damage, Involvement of the Mitochondrial Permeability Transition Pore

Abstract

Brain damage from ischemia-reperfusion and hypoglycemia are major causes of morbidity and mortality. Therapeutic strategies include hypothermia, glutamate-receptor blockade, immunosuppression and lately treatment aiming at preserving mitochondrial integrity and function. Mitochondria are the main producers of cellular energy but mitochondria also participate in cell signaling and take an active part in the life/death decision of a cell. Oxidative stress and high mitochondrial calcium loads can trigger the formation of a large pore in the mitochondrial inner membrane, the mitochondrial permeability transition pore. The consequent disruption of the mitochondrial membrane potential, osmotic swelling and loss of metabolites and mitochondrial proteins through a ruptured outer membrane may lead to immediate or delayed cell death. In this study we demonstrate that isolated mitochondria from different brain regions have different sensitivity to calcium-induced permeability transition and furthermore that this correlates with the selective vulnerability of these regions to ischemia-reperfusion injury. Also, important modulators of the pore such as Bcl-2 and free radical production are altered after ischemia. Thus, Bcl-2 levels decrease at 4h and at 24h after forebrain ischemia in parallel with a 50% increase of free radical production in mitochondria isolated from the vulnerable hippocampus. These alterations are not seen in isolated mitochondria from the more resistant cortex region. We also show that cyclosporin A and MeValCsA, potent blockers of the mitochondrial permeability transition pore, protect neurons from oxygen/glucose deprivation in vitro and from ischemia-reperfusion injury in vivo. Moreover, cyclosporin A protects mitochondria and neurons from hypoglycemic brain damage. We conclude that calcium-induced mitochondrial permeability transition differs between brain regions and that mitochondria from different regions respond differentially to ischemic stress. The results of the present thesis support the view that the mitochondrial permeability transition pore is of importance in the development of brain injury after ischemia-reperfusion and hypoglycemia.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Swedish summary Stroke, hjärtstopp, skallskada och drunkningstillbud drabbar varje år tusentals människor i Sverige. Dessa åkommor leder snabbt till obotliga hjärnskador om de ej behandlas. Hjärnans nervceller är speciellt känsliga för brist på syre och socker, vilket bland annat beror på att ämnesomsättningen är extremt hög i hjärnan och på att energireserverna är mycket små. Detta kan däremot inte förklara varför vissa av hjärnans nervceller är mer känsliga än andra och mycket är fortfarande okänt om vilka mekanismer som styr en nervcells förmåga att överleva efter en skada. Vid stroke och hjärtstopp leder lågt eller obefintligt blodflöde, ischemi, till omedelbar brist på både socker och syre. Brist på socker drabbar patienter som av misstag får en överdos av insulin. Om skadan är kortvarig begränsas nervcellsdöden till vissa mer känsliga delar av hjärnan. Hippocampus är en struktur i hjärnan där nervcellerna är extra känsliga och eftersom hippocampus styr bl.a. minnesfunktioner får små skador ofta svåra följder. En nervcell som skadas eller dör kan oftast inte ersättas med en ny.



En nervcell eller annan cell kan dö på principiellt två olika sätt. Antingen kan den dö omedelbart i anslutning till en skada; cellen kollapsar på grund av brist på energi och om energibristen består under längre tid (varierar med celltyp), så förmår cellen inte återhämta sig. Denna celldöd, som kallas nekros, ser man vid till exempel stroke, som orsakas av en blödning eller av att ett blodkärl täppts till och hindrar blod, syre och socker att nå delar av hjärnan. Vid stroke saknar en viss del av hjärnan blodförsörjning helt och här utvecklas en infarkt, medan randzonen (penumbran) har en nedsatt, försämrad genomblödning. I penumbran kan nervcellerna överleva en tid men dör ofta senare, ibland flera dagar efter skadan, så kallad försenad celldöd. En försenad celldöd i hjärnan ser man också i vissa grupper av mer känsliga nervceller efter en kortare tids hjärtstopp, efter skallskada och drunkningstillbud. Försenad nervcellsdöd är kliniskt relevant och intressant eftersom det finns ett tidsfönster för behandling efter skadan, innan nervcellerna dör. Det finns idag inga effektiva behandlingsmetoder av försenad nervcellsdöd och de bakomliggande mekanismerna är fortfarande okända.



Syftet med denna avhandling har varit att studera hur nervceller dör och om man kan förhindra nervcellsdöd. Avhandlingsarbetet har fokuserats på cellernas energicentral, mitokondrien, och dess roll i förloppet. Mitokondrien producerar i närvaro av syre och socker mer än 90% av all energi som hjärnan använder för sin normala aktivitet och funktion och dåligt fungerande mitokondrier kan därför leda till energibrist, sjukdom och död. Nya rön har lett till spännande kunskap om att mitokondrien, förutom att vara energiproducent, också har en aktiv roll vid försenad nervcellsdöd. Vid både nekros och försenad nervcellsdöd tycks sålunda en försämrad eller förändrad mitokondriefunktion ha stor betydelse.



Mitochondrial permeability transition - övergående förändring i mitokondriens permeabilitet Mitokondrien reglerar nivåerna i cellen av den viktiga budbärarmolekylen kalcium genom att kunna härbärgera stora mängder. När cellen utsätts för höga kalciumkoncentrationer som vid ischemi, men även efter ischemi, kan kalciumupptaget i mitokondrien leda till en övergående förändring i permeabilitet (genomsläpplighet) i mitokondriemembranet (=mtPT). Denna förändring i permeabilitet medför spänningsfall över mitokondriemembranet och därmed upphör energiproduktionen. Mitokondrien svullnar genom vatteninträde (osmos) och potentiellt skadliga proteiner läcker ut i cellen (Figur 5).



Genom att förhindra mtPT skyddar vi nervceller från att dö I tre delarbeten i avhandlingen visar vi hur cyclosporin A, ett läkemedel med specifik blockerande effekt på mtPT skyddar hjärnan i olika skademodeller på råtta: l insulin-orsakat lågt blodsocker (hypoglykemi) - arbete 1 l stroke - arbete 3 l global ischemi (hjärtstopp, drunkning) - arbete 6 Utöver sin effekt på mtPT har cyclosporin A också en dämpande effekt på inflammation och immunförsvar och används vid transplantationer för att förhindra avstötning av organ. Vi provade därför att behandla med N-Me-Val-4-Cyclosporin A (MeValCsA), en substans som modifierats och därför saknar effekt på inflammation och immunförsvar, men som har kvar sin effekt på mtPTP. I arbete 3 visar vi att MeValCsA skyddar lika bra som cyclosporin A vid stroke och i arbete 4 fann vi till vår förvåning att MeValCsA skyddar nervceller i en cellodling bättre än cyclosporin A. Ett speciellt problem vid läkemedelsbehandling av sjukdomar/skador i hjärnan är att läkemedlet måste kunna passera blod-hjärn-barriären (BBB). Cyclosporin A och MeValCsA är båda fettlösliga substanser och borde därför med relativ lätthet passera BBB. På grund av att båda substanserna aktivt pumpas tillbaka till blodbanan från vävnaden sker dock ingen ansamling i hjärnan såvida man inte ger höga doser alternativt skadar blod-hjärn-barriären så att läkemedlen lättare kan passera. I arbete 1 mäter vi koncentrationerna av cyclosporin A i hjärnan och finner att mängden av läkemedlet i hjärnvävnad är hög då en hög dos gives. En förväntad effekt vid behandling med cyclosporin A och MeValCsA vore att fripreparerade mitokondrier och mitokondrier i vävnaden inte svullnar vid en skada och att detta ökar möjligheten till överlevnad. Vi har som första forskargrupp kunnat visa att så är fallet vid insulin-orsakat lågt blodsocker (arbete 1). Med elektronmikroskopi kan vi visa att hjärnmitokondrierna i cyclosporinbehandlade djur förblir normala i storlek och utseende medan hjärnmitokondrierna i icke-behandlade djur är gravt svullna. Cyclosporin-behandling skyddar också nervcellerna från att dö. I fripreparerade mitokondrier från hjärnan visas i samma arbete (arbete 1) och även i arbete 2 och 3 att både cyclosporin A och MeValCsA kraftfullt skyddar mitokondrien från mtPT och svullnad. Tidigare har visats att cyclosporin A skyddar mot mtPT och mitokondriesvullnad i levermitokondrier genom att binda till cyclofilin-D, ett protein i mitokondriematrix, och därmed förhindra att proteinet förflyttar sig till mitokondriemembranet. Därmed minskar risken för mtPT. I arbete 2 och i arbete 4 visas att inte bara cyclosporin A utan också MeValCsA förhindrar att cyclofilin-D förflyttar sig till membranet och samtidigt förhindrar mtPT i hjärnmitokondrier från både mus och råtta.



Regionala skillnader i mtPT korrelerar till skadekänslighet Hjärnans regionala skillnader i känslighet för olika typer av skada försöker vi korrelera till fripreparerade mitokondriers känslighet för kalciumaktiverad mtPT i delarbete 2. Vi finner att mitokondrier från det skadekänsliga hippocampus svullnar lättare av en given kalciumdos än mitokondrier från hjärnbarken och cerebellum. Denna skillnad i kalciumaktiverad mtPT beror inte på olika mängd av mitokondrieproteinet cyclofilin-D. Däremot varierar mängden adenin-nukleotider (ADP/ATP) i mitokondrierna signifikant mellan regionerna, vilket kan förklara skillnaderna i kalciumaktiverad mtPT, eftersom det tidigare har visats att adenin-nukleotider är de mest potenta kroppsegna inhibitorerna av mtPT. I delarbete 5 visar vi i fripreparerade mitokondrier från hippocampus och från hjärnbarken att nivåerna av ett annat viktigt mitokondrie-protein, Bcl-2, förändras efter en ischemisk period. Med en elektroforetisk metod separeras mitokondriens alla proteiner och mängden av ”det goda” proteinet Bcl-2 detekteras med en specifik antikropp. Vi visar att mängden Bcl-2 minskar i den skadekänsliga hippocampus efter ischemi, men inte i den mindre skadekänsliga hjärnbarken. Mitokondriernas förmåga att härbärgera kalcium undersöktes i samma arbete och vi fann att mitokondrier från hippocampus har en sämre kapacitet att härbärgera kalcium 24 tim efter en ischemiperiod jämfört med kontrollmitokondrier. Vid samma tidpunkt, 24 tim efter ischemin, fann vi att också att produktionen av fria syreradikaler är ökad med 50% i mitokondrier från hippocampus jämfört med kontrollmitokondrier.



Slutsats Avhandlingens resultat visar att mtPT existerar i hjärnans mitokondrier och att mtPT varierar mellan mitokondrier från olika regioner, vilket korrelerar till de olika regionernas skadekänslighet. Läkemedel som effektivt kan blockera mtPT skyddar mot olika typer av skada i nervceller och i hjärnan, och vi tror att denna grupp av läkemedel i framtiden kan komma att få betydelse vid behandling av patienter med såväl akuta hjärnskador som vid neurodegenerativa sjukdomar.

• author: Friberg, Hans
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Nicotera, Pierluigi, University of Konstanz, Germany
• organization: Wallenberg Neuroscience Centre, Lund
• publishing date: 1999
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Neurosciences
• keywords: mitochondrial permeability transition pore, mitochondria, apoptosis, neuronal death, brain, ischemia, hypoglycemia, Neurology, neuropsychology, neurophysiology, Neurologi, neuropsykologi, neurofysiologi
• pages: 144 pages
• defense location: Wallenberg Neuroscience Center, University Hospital, 221 85 Lund
• defense date: 1999-10-22 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MEXB-1022-SE
• ISBN: 91-628-3772-9
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Experimental Brain Research (0131000120)
• id: 01a65fd1-6fdf-43d2-8032-edc137244478 (old id 39934)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:03:24
• date last changed: 2018-11-21 21:02:23