Discordant Neural Xenografting: Analysis and Modulation of Immune Responses

Abstract

Transplantation of embryonic human neural tissue can restore function in patients with Parkinson’s disease, but there is a severe shortage of donor tissue which limits the applicability of the technique. Embryonic neural tissue from other species, xenogeneic tissue, would provide a readily accessible donor tissue with the potential to help patients if the immunological reactions in the host could be prevented. Even if the immune responses in the brain are restricted and xenografts placed in the brain survive longer than when placed in other parts of the body, neural xenografts are ultimately rejected in untreated hosts. In this thesis, we show that porcine dopamine neurons can restore functional deficits when transplanted to hemi-parkinsonian rats. Between 6 and 9 weeks after implantation, the porcine neurons had matured to express a TH+ phenotype, extend axons into the host brain and functional effects were seen in the rats. The optimal age for the donor tissue was found to be embryonic days 26-27. There was no proliferation of porcine TH+ neurons after implantation, although porcine glial cells were observed to proliferate in the grafts. Conventional immunosuppression with cyclosporin A (CyA) did not completely protect porcine neural xenografts in rats from infiltration of immune cells and rejection. We therefore analysed the components involved in the rejection process and demonstrate that the immune response to the discordant neural xenografts is dependent on lymphocytes, but that macrophages, microglia and immunoglobulins are also involved in the rejection process. However, Natural Killer cells that are crucially important in the rejection of organ xenografts do not seem to be important for neural xenografts in the brain, which is beneficial. We further show that human complement factors can lyse porcine neural tissue via antibody binding in vitro, but there was no clear protective effect when we grafted porcine neural tissue to complement deficient mice. The role of complement factors and antibodies in the rejection of discordant neural xenografts appears to be an enhancement of the cellular immune responses, in contrast to any direct lytic effects or hyper acute rejection. A combination of CyA or tacrolimus with prednisolone or mycophenolate mofetil (MMF), suppressing broader aspects of the immune response than CyA only, led to an unimpaired graft survival for 14 weeks in rats. We also tried an alternative method of manipulating the immune responses, short-term blockade of co-stimulatory signals, which potentially would be more specific and have less side-effects. Injections with CTLA4Ig and antibodies against LFA-1 during the first 10 days after grafting led to large grafts with minimal infiltration of immune cells at four weeks in mice lacking the co-stimulatory molecule CD40 ligand. In conclusion, embryonic porcine neural tissue is a promising donor tissue for transplantation in neurodegenerative disorders. The treatment of preference would be tacrolimus and MMF, in combination with short-term depletion of xenoreactive antibodies during the period that the blood-brain barrier is open. Before clinical trials are initiated, we suggest that the immunosuppressive regimens are tested in primate models and that the methods with co-stimulation blockade are investigated further.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Transplantation av dopaminceller från mänskliga foster kan förbättra funktionen hos patienter med Parkinsons sjukdom (Lindvall 1997, Björklund 2000a). Man har kunnat visa att transplantaten har återställt dopaminproduktionen i striatum till normala nivåer i flera fall, och till 70-80% av normalt i majoriteten av de patienter som transplanterats i Lund. Transplantaten har visats fungera länge, upp till 10 år efter transplantationen i ett fall som nyligen redovisats i en vetenskaplig publikation (Piccini 1999). Man har också kunnat se att nervcellerna i transplantatet skapar funktionella förbindelser med nervceller i cortex, där viljemässig motorik initieras (Piccini 2000). Vävnaden måste tas tillvara från aborterade foster, vilket är problematiskt eftersom tillgången på vävnad är mycket begränsad och i många länder etiskt oacceptabel. Om man skulle kunna använda nervceller från andra djurarter (xenotransplantation) som donatorsvävnad skulle detta öka tillgången och möjligheten att kontrollera vävnaden för eventuell viral eller bakteriell smitta.



Bristen på mänskliga organ för bland annat hjärt- och njurtransplantation har lett till forskning där man hoppas kunna använda grisorgan för transplantation till människor. Organ och celler från grisar och människor har mycket lika struktur och funktion, och acceptansen för att använda grisvävnad är hög då människan redan utnyttjar grisar till mycket stor utsträckning i födoproduktion. I en undersökning som gjordes av socialstyrelsen 1999 svarade 73% av allmänheten och 80% av njursjuka patienter att de skulle acceptera ett transplantat av nervceller från grisar om de hade Parkinsons sjukdom, och transplantatet skulle kunna hjälpa dem (Xenotransplantations kommittén 1999). I undersökningen svarade sammanlagt 858 personer. 90-95% av de tillfrågade var positiva till fortsatt forskning inom området. Mycket forskning pågår för närvarande angående om transplantationer av grisorgan till människa kan vara skadlig, om smitta kan överföras till människa från grisar, eller om andra negativa effekter kan uppstå vid xenotransplantation. Inga rapporter har hittills visat på några sådana negativa effekter.



I den här avhandlingen visar vi att nervceller från grisar kan återställa den motoriska funktionen i en rått modell av Parkinsons sjukdom (artikel 3). Andra studier har visat att grisceller kan bilda specifika nervförbindelser med mänskliga celler, och att fysiologin och neurobiologin hos dopaminerga grisnervceller verkar överensstämma med mänskliga nervceller. Det största problemet med xenotransplantation är därför den immunologiska avstötningsreaktionen, som sker därför att människans immunförsvar känner igen griscellerna som "främmande" och angriper dem. Hjärnan är ett speciellt organ i transplantationssammanhang, eftersom avstötningsreaktionerna där är mycket mildare än i övriga kroppen (Widner 1988, Barker 1977). Man tror att detta beror på att hjärnan är så viktig för organismens överlevnad att den måste skyddas från inflammation i största möjliga mån. Därför bidrar olika faktorer i hjärnvävnaden till att begränsa immunologiska reaktioner. Trots detta avstöts xenotransplantat i hjärnan, dock efter längre tid än xenotransplantat i övriga kroppen. I denna avhandling har vi syftat att kartlägga hur avstötningsreaktionerna går till, och hur man skulle kunna förhindra dem med minsta möjliga biverkningar för patienterna.



Vi har visat att transplantaten överlever längre i transgena möss som saknar immunoglobuliner, antikroppar (artikel 5). Antikropparna kan binda till xenotransplantatet i synnerhet de första veckorna efter transplantationen, då hjärnvävnaden är öppen för diffusion av större molekyler på grund av det kirurgiska ingreppet. Möss som saknar en antigen-presenterande molekyl, CD1.1 har också en förlängd transplantatöverlevnad, vilket visar att CD1.1 troligen är involverad i presentationen av gris-antigen (protein från gris cellerna) till immunförvaret (artikel 6). För transplantation av hela organ, såsom hjärta och njure, från gris till människa är en celltyp som kallas Natural Killer celler mycket viktiga, och leder till en snabb förstörelse av griscellerna. I den här avhandlingen visar vi dock att dessa celler inte är viktiga för avstötningen av grisceller i hjärnan, vilket är positivt och en underlättande faktor för nervcells xeno-transplantation (artikel 6). Komplementsystemet leder också till snabb avstötning av grisorgan som placeras i människa, vilket kallas hyperakut avstötning. Vi har visat att någon sådan hyperakut reaktion inte sker i hjärnan, och att komplement systemet inte verkar ha en avgörande roll för avstötningen av våra transplantat (artikel 7). I stället förstärker komplement systemet de cellulära avstötningsmekanismerna på ett sätt som är lättare att kontrollera med immunhämmande läkemedel. Om man kan förhindra bindandet av antikroppar och komplementfaktorer till xenotransplantatet under de första veckorna efter nervcells-transplantation till hjärnan, är det möjligt att transplantatet skulle klara sig bättre och att den nödvändiga mängden immunhämmande läkemedel skulle bli mindre i fortsättningen.



Vidare visar våra resultat att de cellulära mekanismerna vid avstötningen är mycket viktiga. De celltyper som är viktiga är olika typer av vita blodkroppar, det vill säga olika typer av lymfocyter och makrofager. Vi har provat olika immunhämmande läkemedel på råttor som fått grisnervcellstransplantat, och med en kombinationsbehandling såg vi att 100% av transplantaten överlevde tre månader efter transplantationen (artikel 4). Med den behandling som tidigare ofta använts för nervcells xenotransplantat, cyclosporin A, såg vi överlevnad i runt 50% av djuren vid tre månader i en studie, och i alla våra studier där vi använt enbart cyclosporin A har vi sett att immunceller samlas i transplantaten (artikel 1, 3 och 4). Den behandling som vi skulle rekommendera är istället en kombination av tacrolimus och mycophenolate mofetil. Tacrolimus kan till skillnad från cyclosporin A komma in i hjärnvävnaden och skydda transplantaten, och biverkningarna av mycophenolate mofetil verkar vara mindre än för andra, liknande läkemedel.



En annan strategi som skulle vara optimal för patienterna är om man skulle kunna ge en kort behandling som skulle göra patienterna toleranta mot grisceller, men lämna immunförsvaret intakt i övrigt. En sådan behandling kallas "toleransinduktion". Immunförvaret känner normalt sett igen kroppens egna celler och angriper inte dem. Toleransinduktion innebär förenklat att man "omskolar" kroppens immunförsvar så att det ser griscellerna som kroppsegna. För att lymfocyterna ska kunna förstöra griscellerna måste de först bli aktiverade av speciella, antigen-presenterade celler och kontakten mellan dessa sker bland annat genom så kallade co-stimulatoriska molekyler. Vi har försökt uppnå toleransinduktion genom att blockera den co-stimulatoriska signalöverföringen de första dagarna efter transplantationen (artikel 8). Vi transplanterade grisnervceller till transgena möss som saknar den co-stimulatoriska molekylen CD40 ligand, och gav dem fem injektioner med CTLA4 och antikroppar mot LFA-1. Efter fyra veckor såg vi stora transplantat i mössen, som var helt fria från immunceller, vilket är mycket lovande.



Sammanfattningsvis har den här avhandlingen visat att grisnervceller är ett lovande alternativ till mänsklig donatorsvävnad för nervcellstransplantation vid Parkinsons sjukdom. Innan tekniken kan användas på Parkinson sjuka människor vill vi dock prova olika immunhämmande behandlingar i ap-modeller, eftersom apornas immunförsvar liknar människans och därför är det bästa sättet att förutspå om en behandling verkligen kommer att fungera i människa. Vi kommer också att fortsätta försöken med toleransinduktion som skulle vara det bästa alternativet för patienterna om den lyckas. Det är min förhoppning att den forskning som presenteras i den här avhandlingen i framtiden kommer att leda till nytta och lindring för patienter med Parkinsons sjukdom och andra degenerativa sjukdomar i nervsystemet.

• author: Larsson, Lena Cecilia
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Sachs, David H., Harvard Medical School, Boston
• organization: Neurobiology (research group)
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Neurosciences
• keywords: neuropsykologi, Neurologi, neurofysiologi, neurophysiology, neuropsychology, Neurology, immunosuppression, immunology, xenograft, pig, Parkinson's disease, intracerebral transplantation
• pages: 206 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg Neuroscience Center
• defense date: 2001-02-16 10:15:00
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 75fb770c-e78b-4370-a549-3b2811f0309d (old id 41270)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:56:04
• date last changed: 2018-11-21 21:08:03