Structural studies of metal-binding proteins revealing dynamic behaviour

Abstract

The Mg²⁺ and Mn²⁺ structures of calbindin D_9k have been determined and they reveal a conformational change compared to the structures of apo and (Ca²⁺)2-calbindin D_9k. These findings are unique, since normally calcium and not magnesium is known to induce conformational changes of EF-hand proteins. It has also been shown that calbindin D_9k binds one Mg²⁺ (K_d=1mM) in the regular C-terminal EF-hand close to physiological conditions. The binding of Mg²⁺ decreases the affinity for Ca²⁺, 5-fold and vice versa.



Two apo staphylococcal enterotoxin H (SEH) structures and one ZnSEH structure have been determined. The structures reveal that SEH lacks the SEB-like binding to MHC class II. Based upon structural differences for the same protein a novel mechanism for SEH recognition of different TcR Vbeta is suggested. The ZnSEH structure together with the homodimers of SEH formed by the crystal packing in two crystal forms imply the approximate area used for Zn²⁺-dependent binding to MHC class II.



A dimeric form of calbindin D_9k has been found. The C-terminal EF-hand of one monomer packs towards the N-terminal EF-hand of the other monomer and vice versa. The dimerisation is primarily caused by the P43M substitution in the linker region between the EF-hands and low pH (= 5.0). The P43M substitution may facilitate 3D domain swapping in two ways; by inducing an extended hydrophobic core in the dimeric form of calbindin D_9k and by stabilizing a partially unfolded form of calbindin D_9k .



The structure of staphylococcal enterotoxin A (SEA) with the substitution H187A (SEA_H187A) has been determined. SEA_H187A has previously been shown to give rise to reduced affinity for Zn²⁺ and a 10-fold decrease in Zn²⁺-dependent binding to MHC class II. The structure and aggregation analyses reveal the importance of additional ligands for SEA_H187A to bind Zn²⁺ at low physiological Zn²⁺ concentrations.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

6 Populärvetenskaplig sammanfattning



6.1 Proteiner produceras av våra gener



Nyligen bestämdes sekvensen för det mänskliga genomet bestående av 30 000 gener. Varje gen kodar för minst ett protein. All information finns i generna men för att förstå vad generna gör behöver vi studera proteinerna de kodar för. I denna avhandling presenteras några proteinstrukturer. Man kan säga att om generna är regeringen så är proteinerna de verkställande utskotten i riksdagshuset. Alla livsprocesser regleras av proteiner. Ribosomen är det organ i cellen där proteiner produceras. Ett protein består av aminosyror som sitter ihop som pärlor på en lång kedja. Aminosyror är små molekyler som består av kol, syre, kväve , väte och ibland svavel. I ett protein sitter aminosyrorna ihop med amidbindningar. Eftersom det finns tjugo olika aminosyror och längden på proteiner varierar mellan 50 och flera tusen aminosyror kan generna koda för ett stort antal proteiner med helt olika funktion.



6.2 Hur ser ett protein ut?



Om man vill veta vad ett protein gör är det viktigt att veta hur proteinet ser ut. Proteiner med liknande utseende har ofta liknande funktion. Proteiner sorteras i olika familjer efter utseende. Det finns tre slags strukturelement som bygger upp ett protein; helixar, beta-flak och loopar. Helixar, är högervridna spiraler med 3.6 aminosyra per varv (Figur 14a, b). Aminosyrorna i spiralen binder till varandra och stabiliserar på så sätt spiralstrukturen. Beta-flak är veckade strukturer, där aminosyrorna på olika beta-strängar binder till varandra (Figure 14c, d). Loopar är mer eller mindre ordnade proteinkedjor som förbinder betasträngarna och helixarna. Proteiner är stora molekyler om man jämför med vattenmolekyler vi dricker eller syret vi andas. Om man jämför med en människa som är knappt två meter lång så är de flesta proteiner mer än 100 miljon gånger mindre (d.v.s. = 10-8 meter). Eftersom proteiner är så små partiklar, kan man inte använda mikroskop för att se hur de ser ut. I denna avhandling har röntgenkristallografi använts för att bestämma proteiners utseende - struktur.



6.3 Röntgenkristallografi



Som namnet, röntgenkristallografi, antyder använder man sig av röntgenstrålar och kristaller i denna metod. Röntgenstrålar är ljus med kort våglängd. En våglängd kan man se som avståndet mellan två vågtoppar på havet. Våglängden på röntgenljuset, (ungefär 10-10 meter) motsvarar bindningsavstånden mellan atomerna i proteinet. Elektronerna i atomerna sprider ljuset, precis som vågor på havet som slår emot en pir och studsar ut igen. I en kristall är proteinmolekylerna packade på ett regelbundet sätt. När röntgenstrålarna träffar kristallen sprids ljuset och kristallens regelbundenhet gör att vågorna förstärks i vissa riktningar, i analogi med havets japanska jättevågor, tsunami, och släcks ut i andra riktningar. Förstärkningarna går att mäta med en detektor. Relationen mellan röntgenvågorna går däremot inte att mäta. För att beräkna var elektronerna sitter i strukturen behövs både styrkan på vågorna eller intensiteten och relationen mellan vågorna, fasen. Flera tekniker finns för att lösa fasproblemet och bestämma en proteinstruktur.



6.4 Superantigener "sätter fart" på immunförsvaret



Immunförsvaret består av bl.a. patrullerande celler, vita blodkroppar, som söker av omgivningen eller den egna cellen och visar vad de hittat på ytan av cellen. Proteiner de hittar delas i små bitar som kallas antigener och skickas ut på cellytan bundet till proteiner som förkortas MHC. Är antigenet främmande så blir det igenkännt av en annan vit blodkropp som kallas T cell och så startas en kaskad av reaktioner som leder till att immunförsvaret aktiveras och kroppen försvarar sig mot det okända. Superantigener är proteiner som produceras av bakterier och virus. Till skillnad från antigener påverkar superantigener immunförsvaret som intakta proteiner. Antigener och superantigener binder till samma proteiner, men antalet celler som kan binda till ett superantigen är betydligt fler och därför leder de till en stor, ofta sjukdomsframkallande uppreglering av immunförsvaret. Varför vill bakterier och virus stimulera immunförsvaret? Dels orsakar superantigenet temporärt kaos i immunförsvaret och dels minskar så småningom en del av de vita blodkropparna kraftigt i antal. På Active Biotech AB använder man superantigeners förmåga att sätta fart på immunsförsvaret för att försöka hitta ett läkemedel mot cancer. Jag har försökt förstå hur superantigenet SEH binder till MHC och T celler genom att bestämma hur SEH ser ut. Dessutom har jag löst strukturen på superantigenet SEA med en utbytt aminosyra, viktig för bindningen till MHC. Avsaknaden av den viktiga aminosyran gör att bindningen till MHC försvagas.



6.5 Metallbindning kan förändra proteinstrukturen



När en metalljon binder till ett protein kan proteinets struktur förändras. Ett exempel är kalciumjoner som slussas in i muskelceller. Kalciumjonerna orsakar muskelkontraktioner och rörelser via inbindning och följande omlagring av proteinstrukturer. Jag har studerat hur bindningen av magnesium till det kalciumbindande proteinet calbindin D9k förändrar den magnesiumbindande loopen samt packningen av helixarna runt denna loop. Vi visar att calbindin D9k binder antingen magnesium i en loop eller kalcium i två loopar vid fysiologiska betingelser. De två olika formerna av calbindin D9k ser olika ut och när magnesium är bundet till calbindin D9k är det svårare för kalcium att binda proteinet och vice versa. Hur skillnaden i struktur är kopplad till proteinets funktion återstår att visa.



6.6 Ett protein som veckats fel



Vi har upptäckt att en muterad form av calbindin D9k antar fel struktur. Lågt pH i kombination med utbyte av en aminosyra i en flexibel loop orsakar strukturomlagringen. Det riktigt veckade proteinet utgör monomerer som binder antingen kalcium i två kalciumbindande loopar eller magnesium i en loop. Det felaktigt veckade proteinet bildar dimerer som binder fyra kalciumjoner. Vid Alzheimers sjukdom verkar en liknande mekanism i hjärnan när ett protein bildar aggregat eller plack på nervcellerna. Skillnaden mellan calbindin D9k och Alzheimers proteinet är att calbindin D9k bildar dimerer och Alzheimers proteinet multimerer. Multimererna ansamlas på nervcellerna och förstör så småningom dessa. Liksom i calbindin D9k fallet orsaks Alzheimers sjukdom av "fel" i genen som ger "fel" aminosyra som i sin tur orsakar "fel" veckning. Med tanke på denna typ av sjukdomar är det viktigt att studera "felveckning". Men även med tanke på att man inte helt förstår sambandet mellan proteinsekvens och proteinstruktur är det viktigt att utöka kunskapen om veckningsprocessen hos olika former av samma protein.

• author: Håkansson, Maria
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Jones, E Yvonne, Cambridge
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Kemi, Chemistry, Molekylär biofysik, Molecular biophysics, zinc, magnesium, superantigen, calbindin D9k, X-ray crystallography, staphylococcal enterotoxin, structure, Chemical technology and engineering, Kemiteknik och kemisk teknologi
• pages: 100 pages
• defense location: K:A at the Center of Chemistry and Chemical Engineering
• defense date: 2001-05-04 14:00:00
• language: English
• LU publication?: yes
• id: aeb9fada-efb6-45ab-9156-0dd4f7f228be (old id 41526)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:03:57
• date last changed: 2018-11-21 21:02:26