Inflammation and neutrophil recruitment in healing of colonic anastomosis

Abstract

Wound healing is a multistep process with an initial inflammatory response, followed by synthesis of extracellular matrix components and finalized by a repair phase. One main goal was to determine the impact and adhesive mechanisms of neutrophil recruitment in anastomotic healing in the colon. Passive immunization against CD18 abolished anastomotic accumulation of neutrophils, whereas no effect on breaking strength was observed. Another aim was to develop a new approach to study anastomotic repair and to compare it with mechanical methods, such as breaking strength and bursting pressure. By application of this radiological approach, it was observed that the integrity increased progressively after operation. No change in breaking strength was observed up to three days postoperatively, in contrast to anastomotic bursting pressure that increased progressively. Notably, integrity and bursting pressure increased in parallel to the accumulation of neutrophils in the anastomotic segment. Local irradiation, enhanced neutrophil influx but did not increase leakage, and administration of chemotherapy, decreased neutrophil influx but increased anastomotic leakage. Moreover, anastomotic leakage and mortality increased in rats with a diverting colostomy. By application of intravital microscopy, it was shown that a P-selectin antibody, but not a L-selectin antibody, abolished TNF-a-induced rolling and concomitantly caused a marked attenuation of firm adhesion and tissue accumulation of neutrophils. TNF-a production was markedly increased and inhibition of P-selectin abolished neutrophil recruitment in colonic anastomosis in animals with experimental colitis. However, this inhibition of P-selectin fraction and neutrophil accumulation had no effect on anastomotic leakage in the inflamed colon. In conclusion, this thesis presents a novel approach to study anastomotic repair in the rat colon by use of radiological examination of contrast media leakage. Moreover, breaking strength is not sensitive enough to detect early changes in anastomotic healing, whereas bursting pressure time-dependently increases up to three days after formation of colonic anastomosis. Finally, it is concluded that neutrophils do not exert a negative influence on the normal non-infected repair process of colonic anastomosis.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Förmågan hos levande vävnader att läka skador är en basal faktor för överlevnad och utgör grundförutsättningen för all kirurgisk verksamhet. Det finns lokala skillnader beträffande celltyper och tidsförlopp, men mycket talar för att sårläkningsprocessen är principiellt likartad i alla vävnader. Sårläkning indelas i olika faser, varav den första utgöres av en inflammatorisk reaktion. Inflammation har till uppgift att skydda mot främmande organismer och rensa såret. En central faktor i den inflammatoriska processen är rekryteringen av vita blodkroppar (leukocyter), vilket sker genom aktivering och utsöndring av specifika signalsubstanser och uttryck av adhesionsmolekyler.



CD11/CD18 är en central adhesionsmolekyl i processen att rekrytera leukocyter. För att vidare utreda effekten av leukocytrekrytering, gjordes försök där CD18 blockerades efter operation i hud (hudflap) och tarm (anastomos). I delarbete ett fann vi att administration av en funktionsblockerande antikropp nästan fullständigt hämmade rekryteringen av neutrofiler. Intressant nog kunde konstateras att inhibition av neutrofilrekryteringen ökade vävnadsviabiliteten i hud. Däremot kunde ingen effekt av CD18 inhibition observeras på anastomosläkning. Dessa resultat talar för att leukocytrekryteringen inte påverkar läkningen på samma sätt i alla organ, vilket måste övervägas när antiinflammatorisk behandling ges för att förbättra läkning.



Operationer på tjocktarm (kolon) och ändtarm (rektum) är vanliga ingrepp. En stor risk med sådana ingrepp är att bristande läkning i sammanfogningen av tarmen (anastomosen) orsakar läckage av tarminnehåll ut i bukhålan, som i sin tur är potentiellt livshotande. Trots att problemet med defekta anastomoser är läckage, utvärderas ofta tarmläkning i experimentell forskning med mekaniska metoder vilka mäter hållfasthet (draghållfasthet = breaking strength eller tryckhållfasthet = bursting pressure). För att kunna studera förekomsten av läckage, har vi utvecklat en modell med kontraströntgen på råtta. Vi fann i delarbete två, att alla tekniskt optimala anastomoser var helt täta omedelbart efter operation och förblev täta följda upp till fem dagar. Defekta anastomoser var alla otäta direkt efter operation, men tätade till 100 % efter 12 timmar och förblev täta följda upp till tre dagar. I våra undersökningar rörande breaking strength fann vi inte någon ändring av hållfastheten i tidiga förloppet (0-3 dag). Bursting pressure uppvisade däremot en tidig dynamik, med successivt stigande hållfasthetsvärden 0-72 timmar. Resultaten tyder på att bursting pressure är användbar för studier av tidig läkning, medan breaking strength är för okänsligt för detta. Hypoteser har gjort gällande att det inflammatoriska svaret och leukocytrekrytering kan vara negativt för normal läkning. Vid mätning av myeloperoxidas (MPO), som mått på leukocytrekryteringen, fann vi att maximum nås samtidigt som anastomosen tätar. Och omvänt när anastomosen var svagast var MPO lägst. Detta talar således för, att ansamlingen av leukocyter inte har någon negativ inverkan på normal anastomosläkning. I linje med den här slutsatsen fann vi också att strålbehandling som ökade MPO inte påverkade anastomosläkningen. Dessutom kunde slås fast att cytostatika (5-FU) minskade MPO men också störde anastomosläkningen.



Kolostomi (”påse på magen”) användes hos högriskpatienter för att undvika anastomoskomplikationer. Kliniska undersökningar har dock visat att frekvensen av läckage möjligen kan öka med avlastande stomi. I delarbete tre undersökte vi därför effekten av kolostomi, i en modell med daglig röntgen (dag 0-4 & dag 7). Vi fann då att läckageindex (procent dagar med läckage) var 29 % i gruppen med avlastande stomi, men endast 7 % i gruppen utan avlastande stomi, vilket bekräftar fynden från de kliniska undersökningarna. Vidare var viktminskning postoperativt och dödligheten påtagligt ökad i gruppen med stomi. Beträffande hållfasthet, mätt som breaking strength på dag 7, sågs emellertid ingen skillnad mellan grupperna. Betydelsen och indikationer för kolostomi i kliniska sammanhang kan därför behövas att reevalueras.



Ett av de viktigaste ämnena som frisätts i samband med inflammation är tumor nekros faktor-alpha (TNF-?). I flera fall av nyare behandling av inflammatoriska sjukdomar, har strategin inriktats på att hämma TNF-?, som också är central för leukocytrekryteringen. Leukocytrekryteringen från blodbanan till den skadade vävnaden är en flerstegsprocess, som består av rullning, adhesion och transmigration. Rullningen har visat sig vara beroende av selectiner (P-, E- & L-selectin), medan den fasta adhesionen styrs av integriner på leukocyter (?1- & ?2-integriner, ex CD18). Det är inte känt vilka adhesionsmolekyler som är viktiga vid leukocytrekryteringen i samband med TNF-? aktivering. I delarbete fyra visar vi att rullningen vid TNF-? aktivering framför allt är beroende av P-selektin, medan L-selektin inte tycks spela någon större roll. Vidare ses att rullningen är central för den fasta adhesionen och transmigrationen vid TNF-? aktivering. Dessa fynd talar för att P-selektin kan vara en central angreppspunkt vid behandling av inflammatoriska sjukdomar. Vi överförde den röntgendiagnostiska metoden till möss och studerade anastomosläckage i samband med inflammation i tarmen. Det kunde konstateras att tarmläkningen var påtagligt störd vid pågående inflammation. Vi kunde hämma rekryteringen av neutrofiler genom blockering av P-selectin funktionen, men detta hade ingen effekt på anastomosläckaget. Dessa resultat antyder att andra faktorer än neutrofilinfiltrationen är viktiga för störd tarmläkning i samband med inflammation. Man kan spekulera att leukocytoberoende aktivering av collagenaser och/eller proteaser (ex MMP) är bidragande orsaker till defekt läkning. Vidare kan den här modellen med möss vara utomordentligt viktig för att möjliggöra studier på genmodifierade djur. Detta kan i sin tur vara avgörande för inte bara en djupare patofysiologisk förståelse av mekanismer bakom anastomosinsufficiens men också för utveckling av bättre behandlingsmetoder.

• author: Månsson, Peter
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Sjödahl, Rune, Linköping University, Sweden
• organization: Surgery (research group)
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Surgery
• keywords: Surgery, experimetnal, anastomotic healing, Inflammation, neutrophil redruitment, orthopaedics, traumatology, Kirurgi, ortopedi, traumatologi
• pages: 113 pages
• defense location: lecture room, Surg. Clinic Malmö
• defense date: 2001-10-10 10:15:00
• ISBN: 91-89625-04-8
• language: English
• LU publication?: yes
• id: d1da7de6-9ece-4290-8a9b-e42324524396 (old id 41815)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:16:50
• date last changed: 2018-11-21 21:03:48