Effects of ethanol on muscarinic acetylcholine receptors in nerve cells

Abstract

This thesis focused on the mechanisms involved in the effects of long-term ethanol treatment on mAChRs and their coupled-signal transduction pathway in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. All 5 subtypes of mAChRs were expressed in these cells. Acute ethanol exposure induced a minor and transient decrease in the number of cell surface mAChRs, which could not account for the previously described pronounced and long-lasting inhibition of receptor-stimulated IP3 formation. Both mAChR number and stimulated PLC activity were increased after long-term ethanol treatment. Up-regulation of mAChRs was paralleled by a subtype-specific increase in mRNA levels of M1, M2, M4 and M5 mAChR subtypes, and a decrease in mRNA levels of the M3 mAChR subtype. Levels of M2 and M4 mRNA were most sensitive to the effects of ethanol. Together with the finding that up-regulated mAChRs after short ethanol exposure times were not capable of stimulating PLC, it is conceivable that these receptors may be M2 and/or M4 subtypes, with appearance of PLC-coupled mAChRs at the cell surface, first after prolonged ethanol exposure times. Our results also show that the ethanol-induced up-regulation of mAChR number can be blocked by both PKC and an NO-donor, and reproduced by PKC- and nNOS-inhibition. Furthermore, long-term ethanol treatment of the cells resulted in decreased levels of NO. Thus, PKC- and/or NO-dependent mechanisms may be involved in the long-term ethanol-induced up-regulation of mAChRs. On the other hand, the mechanisms involved in the ethanol-induced potentiation of mAChR-stimulated PLC activity were not PKC-sensitive, suggesting that at least 2 kinds of mechanisms are responsible for the effects of ethanol on mAChR number and PLC activity, a PKC-sensitive and a PKC-insensitive, respectively.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING (Popularized summary in Swedish)



Alkohol inta's för sina effekter på hjärnan och ger upphov till välbehagskänslor och berusning. Alkoholmissbruk är dock skadligt för hjärncellerna. När alkoholmissbruket dessutom är för långvarigt, uppstår förändringar i hjärnan, som avser att kompensera för alkoholeffekten, vilket medför att alkohol måste inta's i allt större mängd för att ge upphov till samma effekt. Hjärnan har då utvecklat toleran's för alkohol. Med andra ord, hjärnan har lärt sig att arbeta med alkohol och steget är inte långt till att den inte längre kan fungera utan alkohol. Detta kalla's beroende. Alkoholberoende är mycket starkt, därför att det är både psykiskt och fysiskt, då alkohol också påverkar hjärndelar som är viktiga för styrning av kroppsliga funktioner. Om alkohol försvinner ur kroppen, uppstår därmed obehagliga och ibland livshotande symtom. Detta kalla's abstinen's. Man vet idag inte exakt hur alkohol verkar i hjärnan och därför är det svårt att behandla alkoholism och förebygga alkohol-orsakade hjärnskador. Nervceller kommunicerar med hjälp av signalsubstanser som fungerar som budbärare (neurotransmittorer) mellan cellerna. Neurotransmittorerna binder till mottagare (receptorer) på eller i cellerna. Beroende på vilken neurotransmittor en cell tar emot och vilken receptor neurotransmittorn påverkar, uppstår ett svar från cellen. En orubbad sådan kommunikation mellan nervceller är förutsättningen för en adekvat hjärnaktivitet. Man vet nu att alkohol påverkar ett flertal neurotransmittorer och receptorer i hjärnan, och man tror att detta kan förklara de flesta alkoholeffekterna i centrala nervsystemet. Genom att störa cellerna's normala signalöverföring, stör alkohol även cellerna's genuttryck, vilket tro's ligga till grund för alkoholberoendet's bestående karaktär. Acetylkolin (ACh) är en viktig neurotransmittor i hjärnan. Den binder till två typer av receptorer, nikotina och muskarina. Muskarina acetylkolinreceptorer (mAChR) är den vanligast förekommande typen och finn's i viktiga hjärndelar, som spelar stor roll för inlärning och minne, kontroll av kroppsliga rörelser och belöningskänsla. Det finn's fem kända subtyper av mAChR, som kalla's M1-M5. Stimuleringen av mAChR-subtyperna M1, M3, och M5 med ACh leder till aktiveringen av fosfolipa's C (PLC) som spjälkar vissa membranfetter till inositol 1,4,5-trisfosfat [I(1,4,5)P3] och diacylglycerol (DAG). I(1,4,5)P3 frisätter calcium (Ca2+) i cellen, som tillsamman's med DAG aktiverar proteinkina's C (PKC). Aktiverad PKC sätter fast fosfatmolekyler (fosforylerar) på en mängd olika äggviteämnen i cellen. Fosforyleringen påverkar äggviteämnena's funktion, vilket, genom ett flertal steg, påverkar genuttrycket från arvsmassan. Förutom aktivering av PKC, leder en ökning av Ca2+nivån i cellen även till aktivering av kväveoxid synta's (NOS), med bildning av kväveoxid (NO) och påverkan av cellulära funktioner som följd. Aktiveringen av mAChR-subtyperna M2 och M4 ger upphov till hämning eller aktivering av adenylylcykla's (AC) och därmed minskning eller ökning av mängden cykliskt AMP (cAMP), sänkt eller ökad proteinkina's-A- (PKA) och CREB- (cAMP-response element binding protein) aktivitet, med effekter på genuttrycket i cellerna. Man vet nu att hjärnan's kolinerga system (som har ACh som signalsubstan's) är ett av de system som alkohol påverkar och man tror att störning i det systemet kan ha stor betydelse för uppkomsten av toleran's, beroende, nervcellsskador och intellektuella avvikelser ho's alkoholister. Det är därför viktigt att bättre förstå de mekanismer som är inblandade i alkoholen's effekter på det kolinerga systemet. I råtthjärnor och människohjärnor som har exponerat's för höga doser alkohol under lång tid har man kunnat hitta ett större antal mAChR än i kontrollhjärnor som inte har exponerat's för alkohol. De mekanismer som ger upphov till den effekten är dock fortfarande oklara. Denna avhandling var ämnad att utreda vilka mekanismer som är inblandade i alkoholen's effekter på mAChR. Som modellsystem använde's humana SH-SY5Y neuroblastomceller (nervcellsliknande celler) som naturligt innehåller både PLC- och AC-kopplade mAChR. Vi visade att alla fem mAChR-subtyperna uttrycke's i dessa celler. Det visade's också att antalet mAChR på cellytan inte kunde förklara de hämmande effekterna av akut alkoholexponering på receptor-stimulerad I(1,4,5)P3-bildning. Denna effekt verkade bero på alkoholeffekter nedanför receptorerna. Exponering av cellerna för alkohol under lång tid (timmar-dagar) ledde till en uppreglering av antalet mAChR och till en potentiering av PLC-aktiviteten. Initialt kunde dock mAChR inte stimulera PLC. Det visade sig att långtidsexponering av cellerna för alkohol ledde till en ökad mängd budbärar-RNA (mRNA) (som är ett mellansteg i omvandlingen av informationen från arvsmassan till färdiga äggviteämnen) för de fem mAChR-subtyperna. Alkohol påverkade mängden mRNA för de olika mAChR-subtyperna specifikt. Det fann's efter 1 och 2 dagar mer mRNA för M1-, M2-, M4-, och M5-subtyperna och mindre mRNA för M3-subtypen. De olika mAChR-subtyperna uppvisade olika känslighet för alkoholeffekterna, med högst känslighet för M2-subtypen. Vid korta alkoholexponeringstider (1-6 timmar), hade bara mRNA för AC-kopplade mAChR ökat, vilket kunde förklara att uppreglerade mAChR initialt inte kunde stimulera PLC. Först efter 6 timmar's alkoholexponering kunde en effekt på PLC-kopplade mAChR mRNA notera's. Vidare visade's att stimulering av PKC blockerade långtidsalkoholeffekterna på antalet mAChR, men inte på mAChR-stimulerad I(1,4,5)P3-bildning. Detta tyder på att alkoholeffekterna på antalet mAChR och på receptor-stimulerad I(1,4,5)P3-bildning orsaka's av två olika mekanismer, en PKC-kopplad mekanism som leder till uppreglering av antalet mAChR och en PKC-oberoende mekanism som leder till en potentiering av receptor-stimulerad I(1,4,5)P3-bildning. Dessutom visade's att antalet mAChR på cellytan ökade när man blockerade antingen PKC eller neuronalt (specifikt för nervceller) NOS (nNOS). Aktivering av PKC och behandling av cellerna med en NO-frisättande substan's blockerade alkoholeffekterna på mAChR. Detta tyder på att PKC och NO är involverade i de mekanismer som leder till förändringar i antalet mAChR vid långtidsalkoholexponering i dessa celler. Alkoholexponering ledde till en do's- och tidsberoende minskning av NO-mängden i cellerna, vilket tillsamman's med ovanstående resultat tyder på att alkohol påverkar mAChR möjligen genom en effekt på NOS och/eller på PKC-aktiviteten. Sammanfattningsvi's visar dessa resultat att alkoholexponering av SH-SY5Y celler under lång tid leder till en uppreglering av antalet mAChR och till en potentiering av receptor-stimulerad PLC-aktivitet. Det ökade antalet mAChR på cellytan beror sannolikt på ett ökat genuttryck av M1, M2, M4 och M5 mAChR-subtyperna. De mekanismer som är involverade i alkoholeffekterna på mAChR är PKC- och NO-känsliga, och det är möjligt att alkohol utövar sina effekter på mAChR genom effekter på NOS och /eller PKC aktiviteten.

• author: Hellsten Caron, Murielle
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Docent Hellström-Lindahl, Ewa
• organization: Department of Laboratory Medicine
• publishing date: 2002
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Neurology
• keywords: Klinisk kemi, Clinical chemistry, nerve cell, SH-SY5Y, NOS, PKC, PLC, Ethanol, mAChR
• pages: 128 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg neurocentrum
• defense date: 2002-01-25 10:15:00
• ISBN: 91-628-5085-7
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. C. Larsson, P. Simonsson, M. Caron and C. Alling (1996)Long-term Exposure to Ethanol Increases the Number and Function of Muscarinic M1 Receptors in Human Neuroblastoma CellsJ Pharmacol Exp Ther 278: 313-319 Article: II. M. Caron, C. Larsson and C. Alling (1999) Chronic effects of ethanol on muscarinic acetylcholine receptors are modulated by protein kinase CAddiction Biology 4: 163-168 Article: III. M. Caron, A. Andersson and C. Alling (2000) Effects of ethanol on phosphoinositide hydrolysis and muscarinic acetylcholine receptor number in SH-SY5Y cellsLife Sciences 67: 447-456 Article: IV. M. Caron, C. Larsson and C. Alling (2001) Ethanol Induces Subtype-Specific Changes in the Gene Expression of Muscarinic Acetylcholine Receptors in SH-SY5Y CellsSubmitted to Journal of Neurochemistry Article: V. M. Caron and C. Alling (2001)Role of Nitric Oxide in Ethanol-Induced Up-Regulation of Muscarinic Acetylcholine Receptors in SH-SY5Y CellsAlcohol Clin Exp Res 25(8):1107-1113
• id: 9d2e32fe-e296-4265-9087-603d6d973f49 (old id 464243)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:20:15
• date last changed: 2018-11-21 20:58:11