Sorting and processing of neutrophil granule proteins

Abstract

The neutrophil granulocytes have a critical role in innate immunity in particular through phagocytosis of microorganisms. Their cytoplasmic granule subsets store digestive enzymes and antibiotic proteins that are released during this event. During the passage in the secretory pathway the granule proteins are retrieved from constitutive secretion to become sorted for storage. The aim of this thesis was to understand retrieval and sorting for storage through studying processing and sorting of MPO, BPI and hCAP-18 and exogenous secretory proteins. We transfected cDNA of these human proteins to the murine myeloid RBL and 32D cell lines. Mutations of cDNA were made before transfection. A propeptide- deleted MPO precursor was not processed to mature MPO but degraded or secreted, indicating that the propeptide is a prerequisite for final processing and targeting of proMPO to granules. Chimeras between the MPO propeptide and secretory proteins prolonged the ER retention compared with that of the native proteins. Thus, the propeptide may mediate the long ER-residence of proMPO. The amino-terminal half of BPI, when expressed alone, was targeted for storage, while the carboxy-terminal half was not, but, it increased the stability of BPI and chimeric proteins, indicating that this half is important for stability while the amino-terminal half may be important for sorting. The non-myeloid LBP and alpha1-microglobulin were targeted to, but unstable, in granules, indicating cell-specific rather than protein-specific sorting in the cells. But not all proteins were sorted, e g sTNFR1 and propeptide-deleted MPO were secreted, suggesting that physico-chemical properties affect sorting. hCAP-18 was targeted, i e missorted, to the lysosome-related organelles of RBL cells with subsequent prematurely processing and degradation. Thus, the results of the thesis indicate cell-specific retention mechanisms for sorting for storage in myeloid cells.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Sortering av bakteriedödande proteiner till behållarna i vita blodkroppar



Vita blodkroppar har en livsviktig roll i det medfödda immunförsvaret som fagocyter, bakterieätare. Denna funktion, första linjens försvar, utövas av neutrofila granulocyter (neutrofiler), en speciell slags vita blodkroppar som är specialiserade på bakterieätning (fagocytos). När bakterier angriper en vävnad vandrar stora mängder av neutrofiler ut ur blodet och bekämpar invasionen. Efter framgångsrikt värv elimineras överflödet av neutrofiler för att förhindra en efterföljande inflammation, som skulle kunna ge allvarlig vävnadsskada och inflammatorisk sjukdom. Genom en kontrollerad form av celldöd (apoptos) går neutrofilerna under på plats och avlägsnas med hjälp av andra celler.



Mitt arbete handlar om neutrofilernas upplagringsstationer, det vill säga behållare inne i neutrofilerna som lagrar bakteriedödande proteiner, vilka hålls i beredskap för att släppas ut vid en bakterieinvasion. Under mikroskopet ser dessa behållare ut som korn, de kallas därför för granula. Hur dessa bildas och hur det kommer sig att deras innehåll med en blandning av toxiska och äggvitespjälkande proteiner kan vara stabilt, utan att förstöras under lagringen, något som skulle ske om proteinerna attackerade varandra, är frågan. Behållarna omsluts visserligen av ett membran som normalt hindrar ett läckage som kunde skada cellen. När tiden är mogen spricker emellertid membranet och behållarna tömmer sitt innehåll utanför cellen eller i s k fagocytvakuoler, där bakterierna hamnat efter fagocytos för att förstöras. Det frisatta granulainnehållet har således en viktig roll i infektionsförsvaret. Uppgiften för mitt avhandlingsarbete är att undersöka hur proteiner i neutrofiler bildas, upplagras och förvaras i behållarna fram tills de frisätts vid en bakterieinvasion.



Cellens proteinfabrik finns i det endoplasmatiska retiklet (som är en speciell celldel). Efter kvalitetskontroll där exporteras de bildade proteinerna till cellens golgiapparat, en destillations- och sorteringsstation där behållare med koncentrerat innehåll av proteiner bildas genom avknoppning. Proteinerna genomgår en mognadsprocess före och efter upplagringen i behållarna. Proteinerna kvarhålls i golgiapparaten för att i koncentrerad form sorteras för upplagring i behållarna. Om de inte kvarhålls försvinner de ut ur cellen med hjälp av transportblåsor som står för en kontinuerlig proteinutsöndring. Vad som styr att vissa men inte andra proteiner lagras i behållarna är inte känt.



Som modellsystem för min forskning har jag av praktiska skäl använt cellinjer, som består av omogna vita blodkroppar som växer kontinuerligt i näringslösning. Både cell- och molekylärbiologiska metoder har utnyttjats för att kunna följa toxiska proteiner på deras väg från framställning i proteinfabriken till upplagring i granula via sorteringsstationen i golgiapparaten.



Myeloperoxidas (MPO), som är ett av de bakteriedödande proteinerna, bildas som en omogen kedja med olika subenheter på rad. Först kommer en sk propeptid, därefter kommer en liten och sedan en stor subenhet. I det endoplasmatiska retiklets proteinfabrik börjar den nödvändiga veckningen av proteinkedjan. Kolhydrater och en järninnehållande grupp tillförs. Proteinet kallas i detta skede proMPO eftersom det ännu inte är moget. ProMPO dröjer sig kvar flera timmar i det endoplasmatiska retiklet innan det exporteras till golgiapparaten. Där sker en fortsatt bearbetning av kolhydraterna (artikel II) varefter proMPO lämnar golgiapparaten för upplagring i behållare. Moget MPO är uppbyggt såväl av den lilla som av den stora subenheten. Den sk propeptiden klyvs av och ingår således ej i det mogna proteinet. Propeptiden befanns vara mycket viktig för sortering och upplagring i behållarna. När vi tog bort den så avstannade proteinbearbetningen; moget MPO kunde inte bildas. Dessutom upplagrades inte propeptid-defekt MPO i granula utan bröts ned eller släpptes ut ur cellen via den kontinuerliga proteinutsöndringen (artikel II). Propeptiden visade sig således vara nödvändig för såväl mognad som sortering och upplagring av MPO. Den slutliga mognaden sker troligen först efter det att proMPO hamnat i behållarna.



För att bestämma vilka delar av granulaproteinerna (dvs de proteiner som normalt upplagras i behållarna) som är av betydelse för sortering och lagring konstruerades sk chimära proteiner, bestående av delar från olika protein. Vi tog MPOs propeptid och kopplade ihop den med vissa proteiner som normalt utsöndras direkt efter sin tillverkning. De sammanfogade proteinerna stannade kvar i endoplasmatiska retiklet längre tid än det normala proteinet (artikel III). Detta innebär att MPOs propeptid har en kvarhållande funktion i endoplasmatiska retiklet, kanske i syfte att ge tid för proMPO att hinna veckas och ta upp sin järngrupp. De sammanfogade proteinerna fastnade emellertid ofta på vägen i cellens kvalitetskontrollsystem. Vi kunde därför inte avgöra om propeptiden är en signal för sortering till behållarna.



Något överraskande var att de omogna vita blodkropparna visade sig kunna kvarhålla och i behållarna upplagra även av oss införda främmande proteiner som normalt inte tillverkas av blodkropparna utan tex av leverceller (artikel I, III). Normalt släpps dessa främmande proteiner ut i blodbanan direkt efter sin tillverkning. Denna upptäckt tyder på att vita blodkroppar, såsom neutrofiler, har en specifik retentionsmekanism (dvs mekanism för kvarhållande) för upplagring i behållarna, något som även skulle kunna utnyttjas för att förändra neutrofilernas innehåll. Denna mekanism gällde dock inte generellt. Somliga proteiner, särskilt om de var stympade eller sammansmälta av två skilda proteiner, accepterades inte för lagring i behållare utan utsöndrades eller bröts ned (artikel II, III). Detta tyder på att upplagringen inte är passiv till sin natur. Kontrollfunktioner förhindrar upplagring av onaturliga proteiner. Specifika sekvenser (sorteringssignaler) för styrning av upplagring kunde inte identifieras. Däremot fann vi att vissa större domäner hos proteinerna var nödvändiga för adekvat upplagring och stabilitet. Ett undersökt proteinet, BPI (bactericidal/permeability-increasing protein) är uppbyggt av två funktionella halvor. Vi fann att den ena halvan påverkade proteinets hållbarhet i cellerna, medan den andra medverkade vid upplagringen i behållarna (artikel I).



Neutrofilerna har flera sorters behållare med olika innehåll. De ingående proteinernas bildas nämligen vid olika tidpunkter och hamnar därför i olika behållare. Om ett protein således skulle bildas vid fel tillfälle och därmed hamna i fel behållare var frågan om det då kunde samsas med de normalt lagrade proteinerna. Med molekylärbiologisk teknik åstadkom vi en tidsförskjuten produktion av ett visst bakteriedödande protein som därmed hamnade i fel behållare och i en för detta protein främmande miljö. Detta ledde till instabilitet hos det felsorterade proteinet (artikel IV). Det normala innehållet i neutrofilernas olika behållare har genom evolutionens försorg anpassats för samexistens så att stabilitet upprätthålls under den relativt långa lagringstiden. Felsorterade proteiner kan således vara instabila i denna miljö. Sammanfattande kan sägas att resultaten tyder på att sorteringen för upplagring i behållarna hos neutrofiler inte är en passiv process. Cellspecifika mekanismer tycks dessutom medföra kvardröjning och upplagring i cellerna där ett proteins fysikalisk-kemiska egenskaper är av betydelse för upplagringen. Mina forskningsresultat har, även om de erhållits genom experiment på cellinjer, kastat nytt ljus över frågor som rör de bakteriedödande proteinernas sortering och lagring i de vita blodkropparnas olika behållare. Kunskapen kan få betydelse för att utveckla nya terapiprinciper vid inflammatoriska sjukdomar.

• author: Bülow, Elinor
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Venge, Per, Akademiska sjukhuset, Uppsala
• organization: Division of Hematology and Transfusion Medicine
• publishing date: 2002
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Hematology
• keywords: secretion, Haematology, extracellular fluids, Hematologi, extracellulära vätskor, cell-specific retention, chimeric, lysosome-related organelles, secretory pathway, propeptide of MPO, azurophil granules
• pages: 124 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg Neurocentrum, BMC, Lund
• defense date: 2002-02-06 10:15:00
• ISBN: 91-628-5095-4
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 1f405ee8-0c38-419f-ab83-cb837644db63 (old id 464254)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:21:41
• date last changed: 2018-11-21 21:10:30