Protease proforms as hematopoietic regulators

Abstract

A common feature in myeloid leukemia is suppression of normal hematopoiesis, leading to infections, bleeding and anemia. It has been suggested for a long time that leukemic cells possess a growth-advantage by overproducing an inhibitor - a leukamia associated inhibitor. Such an inhibitor has been characterized in leukemic cells as well as subpopulations of normal bone marrow and blood cells, suggesting a role in regulation of normal hematopoiesis. In this thesis the leukemia associated inhibitor was identified as a secreted proform of proteinase 3 (PR3), normally found as active enzyme in the azurophil granules of the mature neutrophil. We could also identify other closely related serine protease proforms exhibiting the same inhibitory activity, namely azurocidin (from neutrophils), and granzymes A, B, H, K and M (from cytotoxic T/NK-cells). Our data demonstrate that hematopoietic serine proteases that leak out from cells as enzymatically inactive proforms are able to downregulate S-phase of granulopoietic progenitors. The S-phase downregulation is executed by N-terminal sequences only exposed properly with a preceding N-terminal di-propeptide. We suggest that the central event in S-phase downregulation of granulopoietic progenitors is a nitric oxide (NO)-mediated inhibition of ribonucleotide reductase, a rate-limiting enzyme in DNA-synthesis. We also present evidence for involvement of phosphatidylinositol 3-kinase, Akt/PKB and inducible NOS in the signal transduction. This thesis presents a new principle for regulation of neutrophil production, whereby a proform of an enzyme leaks out from the cell, exhibiting negative feedback on earlier developmental stages of granulopoiesis.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Hematopoes är bildandet av blodceller. Blodbildningen har sin utgångspunkt i benmärgen i stamceller vilka ger upphov till i huvudsak åtta typer av blodceller med var sina specifika uppgifter. De röda blodkropparna transporterar syre från lungorna ut i hela kroppen,blodplättar har sin främsta funktion i att initiera stopp av en blödning,granulocyter och makrofager äter upp invaderande mikroorganismer,eosinofiler tar hand om parasiter,basofiler fungerar i allergiska reaktioner,B-lymfocyter producerar antikroppar riktade mot mikroorgaismer,och slutligen T- lymfocyter känner igen och dödar tumörceller och virusinfekterade celler.Varje dag produceras mellan 500 och 1000 miljarder nya blodceller,varav cirka 200 miljarder är röda blodkroppar och 70 miljarder vita blodkroppar.De olika blodcellstyperna omsätts olika snabbt men antalet celler av varje typ cirkulerande i blodbanan varierar endast inom snäva gränser och flera faktorer spelar in för att hålla systemet i balans. Denna avhandling har fokuserat på regleringen av granulocyt-produktionen,granulopoesen,framför allt under normala fysiologiska förhållanden men även med beröring av blodcellscancer,leukemi. Vid leukemi sker en expansion av omogna benmärgsceller vilket tycks ske,i alla fall delvis,på bekostnad av de normala benmärgscellerna.Förutom de omogna icke-funtionella leukemiska cellerna som svämmar ut i blodbanan är hämningen av den normala blodbildningen anledningen till varför patienterna blir sjuka:de får infektioner, blödningar och försämrad syreupptagningsförmåga. Vid leukemi med ursprung i lymfocyter,lymfatisk leukemi,kan man ofta se att leukemicellerna rent fysiskt tränger ut de normala benmärgscellerna från benmärgen.Vid den andra stora gruppen av leukemier,myeloisk leukemi,med ursprung i förstadier till granulocyter,röda blodkroppar etc,är det inte alltid lika uppenbart att leukemicellerna tagit över utrymmet i bemärgen.Trots frånvaron av stora massor av leukemiska celler i benmärgen vid myeloisk leukemi,ser man ändå tecken på hämmad normal blodbildning.Därför har det under lång tid spekulerats kring att de myeloida leukemicellerna producerar någon typ av faktor som hämmar de normala benmärgscellerna men som inte har någon effekt på leukemicellerna själva.Som belägg för detta fann man att om man odlade benmärgsceller från patienter med myeloiska leukemier i odlingsflaskor,och sedan tog odlingsmediumet och hällde på normala benmärgsceller så såg man en hämmad tillväxt av de normala benmärgscellerna. Denna vid tillfället oidentifierade faktor kallades för leukemi-associerad inhibitor,LAI,men man fann också att en hämmare med samma karakteristika producerades av vissa normala benmärgsceller och blodceller.På det viset formades tanken om en normalt producerad faktor med hämmande effekt på normal hematopoes,och som av någon anledning överproduceras vid myeloisk leukemi,dessutom utan hämmande effekt på leukemicellerna själva. I mitt avhandlingsarbete har jag arbetat med att identifiera denna leukemi-associerade inhibitor, LAI,och andra snarlika proteiner med samma inhibitoriska effekt.En minsta gemensam nämnare har också kunnat föreslås vad gäller den aminosyra-sekvens som utverkar effekten.LAI visade sig vara ett protein som normalt sett finns lagrat i den mogna granulocyten för att användas vid nedbrytning av microorganismer och för att bana väg för granulocyten ut i olika vävnader.Proteinet heter proteinase 3 (PR3)och produceras av förstadier till granulocyter,promyelocyter,under dessas utmognad till funktionsdugliga granulocyter.Under processningen av PR3 läcker mindre mängder ut från cellen istället för att lagras upp inuti cellen.Detta PR3 som läcker ut från cellen är ofullständigt processat med en kvarhängande proteinbit i ena änden,en pro-peptid.Vad vi visar är att den kvarhängande pro-peptiden är en absolut förutsättning för PR3 att fungera som granulopoes-hämmare,och att det fullständigt processade PR3,så som det är lagrat inuti cellen,saknar denna effekt.Vad är det då som är så intressant med detta? Jo,att ett protein avsett som kraftigt vapen i en stridande granulocyt läcker ut i en form som inte besitter proteinets normala funktion (=bryta ned andra proteiner),utan istället talar om för granulocyt-förstadierna att dra ned på produktionen av soldater,dvs granulocyter.Negativ återkoppling (feedback)brukar detta kallas. Förutom för proPR3 har vi lyckats påvisa samma granulopoes-hämmande effekt hos ytterligare ett protein i granulocyten,azurocidin,samt hos granzymerna,fem närbesläktade proteiner i en annan typ av vita blodkroppar,T-lymfocyten. Även i dessa fall är den granulopoes-hämmande effekten helt beroende av en kvarhängande pro-peptid. Vi har också kunnat identifiera flera komponenter av det signalsystem som vidarebefordrar den tillväxthämmande effekten av proPR3 i de granulocytproducerande förstadierna.Det centrala är en hämning av ett unikt protein som förser cellen med byggstenar för DNA-tillverkning.Innan en cell kan dela sig krävs att hela arvsmassan finns i dubbel uppsättning och den enorma fabrikation av DNA som krävs för detta sker under det som kallas för S-fasen (S=syntes,tillverkning).Vad proPR3 åstadkommer är en uppbromsning av DNA-tillverkningen i granulocyt-förstadierna,något som uppenbarligen är reversibelt eftersom cellerna inte dör av det. ProPR3 representerar en ny princip för negativ återkoppling och reglering av blodbildningen.Kvar återstår att utreda betydelsen av denna mekanism i den helhet som kallas för människokroppen, samt att identifiera de sjukliga förändringar hos leukemiceller som leder till okänslighet för denna mekanism.

• author: Sköld, Stefan
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Assoc Prof. Nilsson, Gunnar, Inst for Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory, Uppsala, Sweden
• organization: Division of Hematology and Transfusion Medicine
• publishing date: 2002
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Hematology
• keywords: granulopoiesis proform PR3 NO ribonucleotide reductase, extracellular fluids, Haematology, Hematologi, extracellulära vätskor
• pages: 148 pages
• defense location: Segerfalkssalen, Wallenberg Neurocenter, BMC, Lund
• defense date: 2002-12-02 13:00:00
• ISBN: 91-628-5468-2
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: Sköld S, Rosberg B, Gullberg U, and Olofsson T. (1999) A secreted proform of neutrophilproteinase 3 regulates the proliferation of granulopoietic progenitor cells. Blood 93;849-856 Article: Sköld S, Zeberg L, Gullberg U, and Olofsson T. (2002) Functional dissociation between proforms and mature forms of proteinase 3, azurocidin, and granzyme B in regulation of granulopoiesis. Exp Hematol 30;689-696 Article: Sköld S, Rosberg B, Olofsson T. Structural requirements of PR3 for downmodulation of the S-phase of granulopoietic progenitors. (submitted) Article: Sköld S, Gullberg U, Olofsson T. Neutrophil pro-proteinase 3 (proPR3) induces S-phase arrest in granulopoietic progenitors by inhibition of ribonucleotide reductase mediated by PI3-kinase, Akt/PKB,and nitric oxide.(manuscript)
• id: a62d8d26-4c0b-4bdf-93ad-605b28376792 (old id 465167)
• date added to LUP: 2016-04-04 09:56:38
• date last changed: 2018-11-21 20:55:47