Biocatalytic transamination with recombinant Saccharomyces cerevisiae: Challenges and opportunities

Abstract

Chiral building blocks are important molecules for synthesis of fine chemicals and pharmaceuticals. Biocatalysis has gained in relevance over traditional organic methods for synthesis of chiral compounds, as reactions can be performed at high enantio-selectivity and purity with environmentally friendly, simple, and cheap methods.

The aim of the present study was to explore the feasibility of using metabolically active microorganisms as whole-cell biocatalysts for the production of building blocks containing chiral amine and alcohol functionalities, using both strain and process engineering. I also discuss the possibilities and challenges of finding new enzymes for biocatalytic processes by the construction and screening of metagenome libraries.

This thesis describes the first exploitation of the metabolism of Saccharomyces cerevisiae for the generation of chiral amines via transamination. As a model transamination reaction, the kinetic resolution of racemic 1-phenylethylamine (PEA) to (R)-1-phenylethylamine ((R)-1-PEA) and acetophenone (ACP) was used. A novel ω-transaminase from the plant Capsicum chinense was first evaluated in vitro and was shown to be active at a broad range of pH and to use amine acceptors that can be derived from metabolism of glucose in S. cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli were then compared as hosts for the transaminase from C. chinense, with pyruvate as amine acceptor. Recombinant S. cerevisiae showed lower initial reaction rates than recombinant E. coli. However, yeast had a significantly higher degree of robustness and reached a much higher enantiomeric excess (ee) than E. coli. Transamination was also achieved with glucose as co-substrate in recombinant S. cerevisiae, as pyruvate could be derived from glycolysis. It was also possible to omit the co-factor PLP in the transamination reaction, demonstrating that even PLP could be derived from the metabolism. Comparison of pyruvate and glucose as co-substrate showed that conversion of racemic 1-PEA was higher with glucose. In addition, the viability of the cells was significantly higher with glucose than with pyruvate.

Two chiral compounds, an amine and an alcohol, were then synthesized in a cascade reaction system. The applied model reaction was racemic 1-PEA to (R)-1-PEA and (R)-1-phenylethanol ((R)-1-PE) with co-expression of a transaminase from Capsicum chinense and a reductase from Lactobacillus kefir. The reduction of ACP, which is the by-product of the first reaction, led to decreased inhibition of the transamination reaction and thus to a higher overall conversion of the racemic substrate. The reduction was very efficient, and an ee of > 99% was achieved. A three-fold increase in transaminase gene copy number also led to a two-fold increased conversion, revealing the transamination as a controlling step. Comparison of resting and growing cells showed that even if the growing cells did not result in higher overall conversion of the racemic substrate, the reduction was improved. This was most probably due to better regeneration of the co-factor NADPH, demonstrated by lower accumulation of ACP and more formation of by-product from glucose metabolism under these conditions.

The importance of the enzyme selection was demonstrated by comparing three transaminases from C. chinense, Chromobacterium violaceum, and Ochrobactrum anthropi in S. cerevisiae. It was found that the transaminase from C. violaceum had the highest reaction rate and conversion efficiency of the model reaction (racemic 1-PEA to (R)-1-PEA). This gene was expressed in an engineered strain that should accumulate pyruvate, showing slightly higher conversion than the control strain. In a parallel approach, omission of thiamine in the cultivation medium led to significantly higher conversion if the co-factor PLP was also omitted. Complete kinetic resolution of racemic 1-PEA was achieved with a strain containing several copies of C. violaceum transaminase―and with higher cell loading, no PLP, and glucose as sole co-substrate.

Overall, the work described in this thesis is a step towards a new whole-cell biocatalysis process concept where the microorganism is exploited and engineered as a microbial cell factory for the generation of fine chemicals. In particular, it has demonstrated that sugar metabolism can be redirected towards inexpensive supply of co-substrates and co-factors.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Den här avhandlingen handlar om att skräddarsy mikroorganismer så att de kan utföra specifika kemiska reaktioner. Nästan alla material och produkter vi har omkring oss idag har framställts genom kemiska metoder. Ofta används olja vilken så småningom kommer sina, som utgångskemikalie. När de framställda produkterna sedan förbränns efter användning släpps koldioxid ut vilket leder till klimatförändringar. Ett långsiktigt mål med att använda mikroorganismer för att utföra kemiska reaktioner är därför att kunna ersätta oljan med förnyelsebara råvaror.

Framställningen av kemiska produkter sker oftast med hjälp av katalysatorer vilka definieras av att de höjer hastigheten på kemiska reaktioner utan att själva förbrukas. Katalysatorerna kan till exempel vara organiska molekyler som framställs genom komplicerade processer, eller metaller som kan vara både giftiga och förorena produkten. Biokatalys använder istället enzymer, vilka är biologiska katalysatorer gjorda av protein eller hela celler (vilka innehåller enzymer). Därför är biokatalysatorerna biologiskt nerbrytningsbara samt både billiga och enkla att producera, eftersom man kan odla dem i sockerlösningar eller t.o.m. på avfall från livsmedelsindustrin.

När man har en molekyl kan de kemiska grupperna (delarna), till exempel en amingrupp, peka i olika riktningar. Dessa olika former av molekylen kan ha helt olika effekter eller bi-verkningar i kroppen och om så är fallet får läkemedel bara innehålla den ena formen. Biokatalysatorer är väldigt selektiva och omvandlar bara en av formerna vilket är en mycket användbar egenskap vid läkemedelstillverkning. Dessutom kan de ibland framställa kemiska byggstenar eller hela läkemedel i ett enda processteg, medan kemiska processer kräver många processteg. Processer med biokatalysatorer är även användar- och miljövänliga p.g.a. att man kan använda vatten som lösningsmedel istället för andra giftiga lösningsmedel.

I mitt arbete har jag använt hela jästceller som biokatalysatorer. Dessa har ett flertal fördelar jämfört med att utnyttja enzymer som upprenats från celler. Hela celler är t.ex. mycket billigare att producera än upprenade enzymer eftersom man slipper hela uppreningsprocessen. Speciellt reaktioner som kräver flera steg och många enzymer är bra att utföra i hela celler eftersom alla enzymer kan produceras direkt i cellen. Vidare kan man utnyttja cellens egen metabolism för att producera ämnen cellen behöver använda som bi-ämne i reaktionen, för att framställa kemiska byggstenar eller läkemedel. Nackdelar med hela celler är dock att problematiska bi-produkter kan bildas och att transporten av utgångskemikalie och produkt till och från cellen kan vara begränsande. Slutligen kan både utgångskemikalien och produkten vara giftiga för cellerna.

Inom avhandlingsarbetet har jag studerat två olika sorters reaktioner, (I) transamination där en amingrupp flyttas från en molekyl till en annan och skapar en ketongrupp där amingruppen tidigare var; och (II) reduktion där till exempel en ketongrupp reduceras till en alkoholgrupp. Båda dessa reaktioner är viktiga vid framställning av flera olika läkemedel som till exempel används vid behandling av Alzheimer’s, diabetes eller HIV. För att kunna utföra dessa reaktioner genmodifierade jag flera olika jäststammar och visade att dessa kan användas för att framställa byggstenar för läkemedel. Specifikt såg jag att man kan använda genmodifierad bagerijäst för transamination vilket inte var känt sedan tidigare. Jag visar även att man kan låta cellerna metabolisera socker för att framställa bi-ämnen som behövs både i transaminations- och reduktionsreaktionen. På så sätt har mitt arbete bidragit till en ökad kunskap om hur biokatalys med hela celler kan användas.

 

Artikelsammanfattning

I artikel I rapporterar jag om ett transaminas (enzymet som utför transamination) från chilipeppar, och visar att det är aktivt vid det pH (surhet) som råder inuti celler. Detta gjorde jag genom att göra en transaminationsreaktion med enzymet vid olika pH. Jag upptäckte även att transaminaset från chilipeppar är mycket selektivt och endast omvandlar amingrupper som pekar i en riktning. Transaminaset är således lämpligt att användas inom biokatalys med hela celler.

I artikel II visar jag en jämförelse av genmodifierad bagerijäst och genmodifierade bakterier som innehöll samma transaminas. Resultatet av studien var att jästen kunde omvandla mer av utgångskemikalien. Jag visade även att socker kunde användas som bi-ämne och omvandlas till pyruvat i cellen, vilket är den molekyl som tar emot amingruppen i reaktionen. Socker är mycket billigare att tillsätta än pyruvat, vilket brukar användas som bi-ämne till transamination med upprenade enzymer. Dessutom levde jästcellerna fortfarande efter att ha utfört reaktionen tre gånger så lång tid när socker användes, jämfört med pyruvat. Detta skulle därför möjliggöra en längre process.

I artikel III beskriver jag möjligheten att koppla en reduktionsreaktion till transaminationen. Den första reaktionen är en transamination där det bildas en keton som sen omvandlades till en alkohol i andra steget, med hjälp av ett enzym som heter reduktas. På så sätt kunde jag få jästen att utföra två kemiska reaktioner i ett enda processteg. Transaminationen blev ännu effektivare när cellen innehöll både transaminas och reduktas jämfört med bara transaminas. Detta beror på att ketonen har en inhiberande effekt på transaminationen men när reduktaset eliminerar ketonen, försvinner den effekten.

I artikel IV visar jag en jämförelse av tre olika transaminaser som introducerats i bagerijäst, för att undersöka vilket som ger effektivast reaktion. Två av enzymerna kom från olika bakterier och jämfördes med det från chilipeppar. Transaminaset från den ena av bakterierna var bäst för den visade snabbast reaktion i hela celler. Jag genmodifierade även en jäststam så den innehöll mer av transaminaset från bakterien. Den nya jäststammen omvandlade allt av utgångskemikalien medan omvandlingen i de hittills beskrivna experimenten låg omkring 50%. Till slut visade jag att transaminationen blir effektivare om man inte tillsätter vitamin B1 i växtmediet p.g.a. att jästcellerna då själva bildar mer vitamin B6, vilket behövs för transaminationsreaktionen.

• author: Weber, Nora
• supervisor: Magnus Carlquist
• opponent: Prof. Merja, Penttilä, VTT Technical Research Centre of Finland, Espoo, Finland
• organization: Applied Microbiology
• publishing date: 2014
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Industrial Biotechnology
• keywords: Saccharomyces cerevisiae, transamination, whole-cell biocatalysis, pyruvate, PLP, thiamine, reduction
• defense location: Lecture hall B, Kemicentrum, Lund University, Faculty of Engineering LTH, Getingevägen 60, Lund
• defense date: 2015-01-30 10:30:00
• language: English
• LU publication?: yes
• id: ce01b86b-75e2-40ad-aaa4-8740a1499701 (old id 4864921)
• date added to LUP: 2016-04-04 13:28:21
• date last changed: 2018-11-21 21:14:12