Investigation of Carbohydrate Hydrolysing Enzymes in Applications for Characterisation and Synthesis of Carbohydrates

Abstract

Cellulose and starch are non-toxic, biodegradable and modifiable polymers. These properties have made them increasingly important in industrial products e. g. in pharmaceutical applications and in technical dispersions. By chemical modification of these polymers the physical and chemical properties of the polymer can be adjusted to suit a certain area of application. The characteristics of modified celluloses and starches are to a great extent determined by the chemical nature of the substitutents and by the method used to achieve substitution. It is very important to be able to characterise the substitution pattern, both at the monomeric and at the polymeric level. Enhanced knowledge of the relationships between the substitution methods and the structure and properties of the polymer, can thus be used to create more cost efficient production methods.



The focus of the thesis was on developing analytical techniques that can be used in the elucidation of substituent distribution of modified starches and celluloses by using carbohydrate hydrolysing enzymes as depolymerisation tools. The polymers are too large for most analytical instruments and thus they are made smaller selectively by enzymes. To know how substituents affect the enzymes ability to hydrolyse, the enzymes have to be characterised before they can be used as tools in polymer characterisation. Several analytical techniques (HPAEC-PAD, ESI-MS, SEC-RI) were used to analyse enzyme hydrolysis products. Also, apart from analysing the final products, intermediate products were analysed using µ-dialysis. This provided additional information on the enzymes? specificities. By immobilising the enzymes on a µ-chip reactor we also showed that enzymes are not only useful for cleaving, but also for building new carbohydrates by the covalent linking of a saccharide to an alcohol.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Cellulosa och stärkelse är naturligt förekommande polysackarider, som är uppbyggda av långa rader av flera tusen sammanbundna glukosmolekyler. De är biologiskt nedbrytbara, billiga och dessutom förnyelsebara, och används mycket som råvaror i läkemedels-, livsmedels-, textil-, pappers- och byggnadsindustrin.



För att cellulosa och stärkelse ska kunna användas industrellt måste de vanligtvis förändras så att de får andra och ibland helt nya egenskaper. Detta görs genom kemisk modifiering d.v.s. en eller flera kemiska grupper (sk substituenter) sätts på de sammanbundna glukosmolekylerna. Vilka substituenter man använder beror på vilka egenskaper man vill att producten ska ha. Den industritillverkade polysackaridens funktion påverkas också av var de kemiska grupperna är placerade, både inom varje enskild glukosmolekyl och längs med polymerkedjan.



Industrin är naturligtvis mycket intresserad av att få veta mera om hur polymerenas ursprungliga egenskaper och tillverkningsprocessen påverkar den färdiga modifierade produkten. Ett sätt att komma åt detta samband är att analysera den modifierade polysackaridens kemiska struktur. Det finns en mängd olika analytiska tekniker att ta till, men det finns ingen ?universalteknik? som kan ge hela svaret. Därför måste man använda en kombination av flera tekniker, som tillsammans kan ge en ungefärlig bild av hur strukturen ser ut. Eftersom cellulosa- och stärkelsepolymerer är alldeles för stora för de flesta analysinstrument behöver de klyvas i mindre delar innan de kan analyseras. Märkligt nog påverkar inte det resultatet av analysen, eftersom delarna speglar hela polymeren. Antingen kan polymererna klyvas slumpmässigt lite var som helst, genom att man tillsätter en stark syra eller så kan de klyvas på ett mer systematiskt sätt med hjälp av enzymer. (Enzymer är biologiska molekyler som påskyndar kemiska reaktioner.) Enzymerna hydrolyserar ned polymererna till mindre bitar. Hur stora bitarna blir beror på hur polymeren är substituerad, eftersom vissa substituenter helt eller delvis stoppar enzymerna. För att kunna veta om och i så fall var och av vad enzymerna hindras (olika enzymer påverkas olika mycket), måste de först karakteriseras innan de kan användas i arbetet med att karakterisera polymerena.



Ett av målen med denna avhandling har varit att utveckla nya metoder för att analysera dessa nedklyvna bitar med hjälp av olika analytiska instrument i syfte att använda dessa nya metoder för att kartlägga olika enzymers funktion.I detta kartläggningsarbete är det emmelertid inte bara hydrolysens slutproducter som är intressanta. Man behöver också ta reda på vad som händer under processens gång, hur enzymet klyver och vilka mellanprodukter som bildas. Det innebär att bra analysmetoder också måste kunna följa under tiden den pågår.



Enzymer kan inte bara användas för att klyva polymerer, de kan dessutom användas för att syntetisera eller sätta samman nya, större molekyler från monomerer och andra mindre molekyler. I ett arbete har vi visat hur man kan tillverka hexylglukosider med hjälp av enzymer fastsatta i en reaktor. Enzymsyntes har många fördelar i jämförelse med kemisk syntes. Man kan använda vattenbaserade system och slippa ifrån farliga kemikalier som används idag. Vidare kan man uttnyttja enzymernas specificitet för att syntetisera en specifik produkt istället för att få en blandning av snarlika som sedan måste delas/renas upp.

• author: Nilsson, Carina
• supervisor: Lo Gorton
• opponent: Prof Puls, Jürgen, Institute of Wood Chemistry, Federal Research Centre of Forestry and Forest products, Hamburg, Germa
• organization: Centre for Analysis and Synthesis
• publishing date: 2006
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Analytical Chemistry
• keywords: Analytisk kemi, enzyme hydrolysis, characterisation of carbohydrates, Analytical chemistry, mass spectrometry
• defense location: Sal A, Kemicentrum
• defense date: 2006-06-21 10:15:00
• ISBN: 91-7422-120-5
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Analytical Chemistry (S/LTH) (011001004)
• id: 8b4c0278-0645-4b96-9535-891a3c037cf6 (old id 547002)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:41:23
• date last changed: 2018-11-21 21:06:31