Integration of Molecular Biology and Morphology in Effusions with Focus on in situ Detection of Telomerase and its Components

Abstract

Clinical cytology is a rapid method to detect malignancy in effusions of the serous cavities, but the morphological characteristics of the cells do not always allow diagnosis and a specific marker for malignant cells would improve the diagnostic performance. Telomerase adds telomere repeats to the chromosome ends. It is the most promising universal indicator of malignancy and the project focuses on TRAP in situ, a unique PCR-based method to detect telomerase activity. With TRAP in situ we demonstrated telomerase activity in 95% of all malignant cell populations. Some mesothelial cells and lymphocytes showed weak reactivity. When compared with the results of TRAP using whole cell lysates we found that discrepant results could be due to cell composition and activity intensity in positive cells and we concluded that whole cell lysate TRAP is not a suitable method to detect telomerase in effusions. We further studied the relation between telomerase activity in malignant cells in effusions and prognosis and found that weak telomerase activity in tumor cells was associated with shorter survival times. A possible explanation is that cells with highly aggressive potential may find a way to preserve their telomeres in the absence of telomerase. Telomerase activity correlates to its catalytic subunit, hTERT and immunocytochemical detection of the hTERT protein is an attractive way to detect up regulation of telomerase. As telomerase activity was stronger in malignant than in mesothelial cells absolute quantification of the immunoreactivity would allow the identification of a cut-off level for malignancy. In a pilot study we showed that this could be achieved with time resolved fluorescence (TRF) imaging, a method that has never before been applied to cytological specimens.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Den viktigaste uppgiften inom den kliniska cytologin är att påvisa cancerceller i olika typer av cellprover. Många olika cancertumörer sprider sig till lungsäcken och bukhålan och ger då ofta upphov till vätska (exsudat) som innehåller cancerceller. Ofta kan cancerdiagnosen ställas på grundval av cellernas utseende men detta är inte alltid möjligt, eftersom cancercellerna kan vara svåra att skilja från celler som lossnar från den normala vävnaden (mesotelceller) och som så gott som alltid också finns i vätskan eller från andra celler i exsudat som orsakas av olika godartade sjukdomar. För att patienten så snart som möjligt ska få korrekt behandling är en snabb och säker diagnos angelägen och till hjälp i diagnosen har man numera s.k. markörer, ämnen som är vanligare i vissa cancerceller än i godartade celler, men någon sådan markör som helt säkert påvisar cancer har ännu inte kunnat identifieras. Inom den moderna molekylärbiologin görs ständigt nya rön, nya cellsubstanser upptäckes och om man använder sig av metoder som påvisar dessa substanser i de enskilda cellerna i ett cytologiskt prov kan man när man tolkar resultaten också ta hänsyn till cellernas utseende och därmed erhålla mera information. Detta forskningsprojekts grundidé är just att utnyttja molekylärbiologiska rön och metoder i kombination med cytologisk erfarenhet för att utveckla metoder som kan tillämpas i klinisk cytologisk cancerdiagnostik.



I cellernas kärnor finns kromosomerna som innehåller arvsmassan, dvs. den genetiska informationen. Kromosomändarna har en speciell struktur som syftar till att skydda det genetiska materialet. Dessa strukturer kallas telomerer och består av tusentals kopior av en speciell sekvens av nukleotider, (byggstenarna i det genetiska materialet). Normala celler förnyas genom att dela sig och vid varje delning förkortas telomererna tills de når en viss kritisk längd då cellen inte längre kan dela sig. Detta anses vara en mekanism bakom det normala åldrandet. Cancerceller kan dock dela sig i det oändliga och i de allra flesta fall beror det på att de har ett enzym, som kallas telomeras. Genom telomeras ersätts telomerförlusten och cellen kan fortsätta att dela sig och därmed växa okontrollerat. Telomerasaktivitet kan också påvisas i vissa typer av normala celler med snabb omsättning, t.ex. celler i tarmslemhinnan och i hudens djupa lager men i övrigt saknas enzymet eller har låg aktivitet i normala kroppsceller.



Telomeras är därför den mest lovande universella indikatorn på cancer. Telomeras kan påvisas i extrakt från celler och vävnader med en metod som kallas telomere repeat amplification protocol (TRAP), men den metoden har nackdelen att enzymaktiviteteten inte kan relateras till cellernas utseende eller typ och det går heller inte att avgöra om alla celler i en tumör är lika starkt positiva. Metoden har därför inte fått genomslag i den cytologiska diagnostiken.



Med en unik metod, TRAP in situ, som baserar sig på extraktmetoden, och som utvecklats av en japansk forskargrupp kan man bestämma telomerasaktivitet i intakta celler i ett cellprov. Om telomeras finns i provet kommer telomererna att förlängas och genom tillsats av ett fluorescerande ämne som bygges in i telomersekvenserna kommer de positiva cellernas kärnor att lysa när man tittar på provet i ett fluorescensmikroskop.



I det här projektet har vi som första forskargrupp utanför Japan använt TRAP in situ .Med TRAP in situ kunde vi visa att de allra flesta cancerceller i exsudat uttrycker telomeras. Vi fann även att en del mesotelceller innehöll telomeras men i de flesta fall var aktiviteten betydligt svagare än i cancercellerna. Även lymfocyter, en typ av vita blodkroppar, var positiva. Sådana celler finns i ofta i exsudat, men är som regel lätta att skilja från cancerceller och orsakar därför inga tolkningsproblem om man använder in situ metoden. Vi jämförde också TRAP in situ med den traditionella TRAP metoden och fann att de delvis motsägelsefulla resultat som flera andra forskargrupper rapporterat med den traditionella metoden kan förklaras av cellinnehållet i exsudatet. Om det t.ex. finns många lymfocyter i provet ger detta upphov till telomerasaktivitet och om cancercellerna i ett prov är få blir den totala enzymaktiviteten låg, men de positiva cancercellerna syns ändå tydligt med in situ metoden. TRAP in situ är därför en bra metod att upptäcka cancerceller, även om de är få, medan vi kunde konstatera att TRAP extrakt- metoden inte är lämplig för exsudat.



Ett sätt att indirekt bestämma telomeras är att påvisa hTERT (human telomerase reverse transcriptase) som utgör en väsentlig beståndsdel av enzymet och som är nödvändigt för att det ska fungera. Man kan bestämma hTERT med immunocytokemi, en metod som är mycket vanlig i klinisk cytologi och som bygger på den specifika reaktionen mellan en antikropp och ett antigen. När vi använde en antikropp mot hTERT som i många andra studier ansetts vara en lovande markör och jämförde resultaten med TRAP in situ fann vi dock att mesotelceller mycket ofta var hTERT-positiva. Vi var därför de första som kunde rapportera att antikroppen inte kan användas för att påvisa cancer i exsudat. En annan forskargrupp visade senare att just denna antikropp binds till ett annat cellprotein som är involverat i celltillväxt, vilket förklarar reaktiviteten i mesotelceller, vilka ofta befinner sig i tillväxt.



Eftersom TRAP in situ ofta är starkare positivt i cancerceller än i godartade mesotelceller väcktes iden att man genom att kvantifiera reaktiviteten skulle kunna hitta ett gränsvärde för cancer. Samma princip kan tillämpas på hTERT reaktiviteten, eftersom vi även här fann en betydande skillnad i reaktivitetsintensitet mellan cancerceller och mesotel. Traditionell immuncytokemi tillåter inte absolut kvantifiering av det antigen som påvisas men det problemet kan lösas med en ganska ny metod som kallas time resolved fluorescence (TRF). Metoden är alltså en fluorescensmetod och tekniken bygger på principen att man till antikroppen binder en speciell jordmetall som fungerar som signalflagga. Fluorescerande ljus med lång halveringstid kommer att sändas ut och den fluorescens som alltid finns i biologiska prover kommer att hinna försvinna innan man mäter den specifika signalen. TRF har aldrig tidigare använts i exsudat och i en liten testserie visade vi att metoden lämpar sig väl för att kvantifiera immuncytokemisk reaktivitet i denna typ av material. Eftersom de flesta markörer som användes i den kliniska cytologin inte är fullständigt specifika för cancer kan kvantifiering med TRF komma till användning även för andra antikroppar och kan i framtiden bidra till en ännu större säkerhet i cancerdiagnostiken i cytologiska prov.



I ett av delarbetena undersökte vi om det fanns ett samband mellan telomerasaktivitet i cancerceller i exsudat och patienternas överlevnad. När en cancertumör spritt sig till kroppshålorna kan patienten i princip inte botas men överlevnadstiden kan variera betydligt. Hitintills har det gjorts få undersökningar som syftat till att förutsäga prognosen för patienter med cancer i detta stadium. Vi kunde konstatera att patienter med hög telomerasaktivitet i cancercellerna har större sannolikhet att leva längre än patienter med låg telomerasaktivitet i cellerna. Detta var ett oväntat fynd eftersom det är rimligt att anta att celler som producerar telomeras har större förutsättning att växa och överleva men andra mekanismer genom vilka cellerna kan lösa problemet med för korta telomerer finns beskrivna och kan förklara vårt fynd.



Telomeras mätt med TRAP in situ metoden kan alltså användas både för att påvisa cancerceller i exsudat och för att skilja mellan patienter med sannolikhet för lång respektive kort överlevnad. Det senare fyndet kan komma att få betydelse för val av behandling och omhändertagande av patienterna.

• author: Zendehrokh, Nooreldin
• supervisor: Annika Dejmek
• opponent: M.D., Ph.D. Berner, Aasmund, Radiumhospitalet, Montebello, Oslo, Norway
• organization: Pathology, Malmö (research group)
• publishing date: 2007
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Cancer and Oncology; Cell and Molecular Biology
• keywords: pathological anatomy, Patologi (allmän), patologisk anatomi, Diagnostics, Diagnostik, cancer, TRAP in situ, onkologi, Cytologi, cancerology, oncology, Cytology, Medicin (människa och djur), Medicine (human and vertebrates), General pathology, Telomerase
• pages: 118 pages
• defense location: Division of Pathology and Cytology, Entrance 78, Malmö University Hospital, Malmö
• defense date: 2007-03-16 13:00:00
• ISBN: 978-91-85559-17-6
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: N Zendehrokh and A Dejmek. 2005. Telomere Repeat Amplification Protocol (TRAP) in situ reveals telomerase activity in three cell types in effusions: malignant cells, proliferative mesothelial cells, and lymphocytes. Modern Pathology, vol 18 pp 189-96.; N Zendehrokh, J Rehnberg and A Dejmek. 2006. A comparison between NCL-hTERT antibody reactivity and Telomere Repeat Amplification Protocol (TRAP) in situ in effusions. Acta Cytologica, (accepted); N Zendehrokh, L Franzen and A Dejmek. 2006. Weak telomerase activity in malignant cells in metastatic serous effusions correlates with shorter survival time. Acta Cytologica, (accepted); M Hansson, N Zendehrokh, JH Ohyashiki, K Ohyashiki, UB Westman, G Roos and A Dejmek. . Telomerase activity in effusions: The results of TRAP in situ correlate well to malignancy, whereas TRAP assay using whole cell lysate is not a suitable method. (manuscript); N Zendehrokh, J Petersson, Ch Möller, A Bjartell and A Dejmek. . Quantitative Immunolocalization of NCL-hTERT Reactivity in Serous Effusions by Time-Resolved Fluorescence Imaging (manuscript)
• id: 1f6b2550-bece-4e3a-b3ce-c04814fdba7f (old id 548204)
• date added to LUP: 2016-04-01 17:08:52
• date last changed: 2018-11-21 20:47:01