Nanowires for Cell Research

Abstract

This study explores the interaction between living biological cells and semiconductor nanowires.



Biological cells are highly complex and dynamic entities, every one of them with individual characteristics and a high degree of internal and external communication. They respond to and affect their external environment with a huge web of fine-tuned control systems.



Traditional biochemical tools for cell research have predominantly focused on the study of collections of cells and their general properties. Nanotechnology allows fabrication of advanced miniaturized devices, with tailored qualities. The use of nanostructures for cell research is motivated by the possibility of addressing cell-biological issues at the single cell or sub-cellular level, and to do that with large numbers of cells in parallel.



In this thesis epitactic semiconductor nanowires were used to perform novel research on neurons and macrophages, two mammalian cell types with highly specialized properties.



Free standing nanowires, of gallium phosphide (GaP) and galliuim arsenide (GaAs), grown by metal organic chemical vapour deposition (MOCVD), were fabricated and used as a substrate for cell culture, where the properties of cell/wire interactions were examined and utilized.



First, basic relations were investigated. Cells were shown to attach, remain viable and even exhibit strong outgrowth on GaP nanowire substrates. Intense interactions between the wire and the cells were found. The cells could grab, bend and internalize the wires and the wires affected the cellular growth direction, all of which could be used for a variety of applications.



By producing samples with patterns of nanowires, the outgrowth of nerve fibres could be controlled in detail over large areas. Here it was also found that the cells could establish functional adhesion to the wires, thus explaining the wire grabbing earlier noticed. With more advanced wire patterns, the direction of neural outgrowth was controlled and nerve fibres from two different origins could be led to grow close together without overlapping.



Laminin, an important component of the extra cellular matrix of living organisms, had a high tendency of adhering to the nanowires. This was used both to improve the cell viability and to visualize the wires in fluorescence microscopy, by labelling the laminin.



The ability of cells to grow on top of dense nanowire arrays and attach to their tips was used for measurements of cellular mechanical forces. After investigations of the mechanical properties of the GaP nanowires, the cell induced wire bending could be translated to quantitative forces. Optical detection and image processing was employed to resolve picoNewton forces at high temporal and spatial resolution.



From GaAs nanowire templates hollow nanotubes were made. DNA strands were pulled through the tubes to prove their applicability. Modified versions of those tubes were used to transfect macrophages with a molecular dye. The tubes could penetrate into living cells and the viability of cell penetrated by nanotubes could be established.



Finally, macrophage response to suspensions of free nanowires of different materials was investigated. GaP nanowires and nanowires made from nickel, gold and polystyrene were examined. The cells actively engulfed wires of all the materials but the influence on the cells differed. Nickel wires caused the highest number of dead cells, whereas the polystyrene wires made least impact. GaP wires had an intermediate effect.



In conclusion, this work shows that nanowires can interact intimately with living cells and that those interactions can be understood and controlled. Nanowires are highly interesting structures that can be used for multiple applications in sub-cellular cell science.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Sammanfattning

Den här avhandlingen handlar om gränsskiktet mellan nanoteknologi

och cellbiologi, om hur celler och nanostrukturer påverkar varandra, och om hur man kan använda nanopinnar för att studera celler. Å ena sidan vill man kunna mäta egenskaper hos cellerna, det vill säga låta cellerna påverka pinnarna, å andra sidan vill man kunna styra cellerna – låta pinnarna påverka cellerna. I det här arbetet används nanopinnarna till att styra cellutväxt, mäta cellulära krafter, samt injicera främmande material i celler. Dessutom gjordes en mindre undersökning av nanopinnarnas hälsorisker.



Nanopinnar

Nanopinnar är långsmala kristallina strukturer i halvledarmaterial med många potentiella användningsområden, till exempel inom elektronik och optik. De tillverkas genom en sorts epitaxi där ett substrat (ofta av samma material som de senare nanopinnarna) beströs med katalyserande tillväxtpartiklar av guld. I en temperatur- och tryckkontrollerad reaktorkammare tillsätts pinnarnas beståndsdelar i gasform. Tillväxten sker i gränsskiktet mellan guldpartikeln och halvledarytan, så att guldet alltid befinner sig högst upp på den växande pinnen. Pinnarnas tjocklek bestäms av guldpartikelns storlek och deras längd av tillväxttiden. En längd på ett par μm och en diameter på runt 50 nm är lämpliga dimensioner för att studera djurceller på en subcellulär nivå. De flesta djurceller (inklusive människans) är nämligen runt 10–20 μm stora. I det här arbetet användes främst pinnar av galliumfosfid (GaP), stående på galliumfosfid-substrat, för att studera och påverka nervceller och makrofager (vita blodkroppar).



Cellkulturer

I detta arbete odlades och undersöktes celler från två helt olika ursprung. Främst studerades nervceller tillhörande det perifera nervsystemet; det vill säga den del som ligger utanför hjärnan och ryggmärgen. I kroppen ligger nervfibrer till kroppens olika delar samlade i olika nerver. Ute I det perifera nervsystemet finns väldig få kopplingar mellan olika nervceller. Istället löper de flesta nervtrådarna över mycket långa sträckor ut till de områden de innerverar. Nervcellkropparna sitter samlade I särskilda säckar, ganglier, som dessutom innehåller andra celler som är viktiga för att hjälpa nervcellerna. Neurala ganglier kan dissekeras ut och odlas. Deras celler uppför sig då ungefär som när de i sin naturliga miljö drabbas av en skada. Bland annat börjar nervcellerna att skicka ut många, långa nervutskott för återväxt – så kallad regeneration. Kunskap om det perifera nervsystemets återhämtning efter skada är viktig ur ett medicinskt/fysiologiskt perspektiv. Förutom nervceller användes också makrofager, eller ”storätare”. De tillhör de vita blodkropparna och är viktiga aktörer vid kroppens försvar mot såväl bakterier som främmande föremål av icke-biologisk natur. De är väldigt flexibla och brukar i kroppen vandra ut från blodkärlen för att jaga och bekämpa hot ute bland cellerna. Makrofager användes i dessa studier just för sin förmåga att sluka föremål.



Celler på nanopinnar

Studierna började med odlingar av nervceller på substrat med GaP-nanopinnar. Efter att först ha verifierat att materialet inte var akut giftigt – tvärtom visade cellerna god förmåga att fästa, överleva och växa på ytorna – kunde olika interaktioner mellan cellerna och pinnarna studeras. Det visade sig att cellerna sände ut fina utskott som greppade tag om pinnarna, att pinnarna blev böjda av cellernas krafter, att många pinnar blev omslutna av utväxande cellutskott och att många celler blev genomborrade av pinnarna de låg på. Pinnarna kunde också fungera som stängsel och hindra eller styra cellernas utväxt. Dessa interaktioner kunde senare utnyttjas i intressanta tillämpningar.



Utväxtstyrning

Pinnarnas förmåga att kontrollera cellutväxt studerades mer systematiskt med hjälp av prover med stora ytor av pinnar stående i regelbundna mönster. På sådana prover kunde hela nervfiberutväxten noggrant styras, och ändras från ett slumpmässigt virrvarr till jämna och regelbundna rader. Med ett mer avancerat mönster, inspirerat av ett fiskeredskap från stenåldern, kunde utväxtkontrollen förbättras ytterligare. Pinnar ordnade i ett system av korta ”trattar” koncentrerar utväxten till rätt områden. Nervfibrer som kommit fel leds snabbt rätt igen. Med hjälp av sådana mönster kunde nervfibrer av två olika ursprung hållas välseparerade trots att de över långa sträckor tvangs att växa precis bredvid varandra. I samband med studierna om utväxtstyrning konstaterades också att cellerna hade förmåga att etablera specifika fästpunkter till pinnarna, vilket är väldigt viktigt för deras interaktioner. Därtill upptäcktes att laminin, en viktig komponent i den substans som fyller utrymmet mellan celler i kroppen, spontant binder till nanopinnar. Detta kunde sedermera utnyttjas; dels till att förbättra cellernas trivsel på ytorna, och dels till att göra pinnarna självlysande vid mikroskopi. Det senare genom att fästa självlysande antikroppar mot lamininet till dem.



Kraftmätningar

De yttersta utskotten på regenererande nervceller kallas tillväxtkoner och är de strukturer där utväxande nervfibrer visar störst aktivitet. Tillväxtkonerna är handliknande strukturer som, med hjälp av otaliga fingrar som ständigt sänds ut och tillbakabildas, söker efter biokemiska och topografiska markörer som kan leda nervfibern på rätt väg. Cellernas goda förmåga att vidhäfta till nanopinnar, samt deras förmåga att böja pinnarna genom sin aktivitet gjorde det möjligt att mäta mekaniska krafter från tillväxtkonerna. Nervceller odlades på så täta mönster av fluorescens-inmärkta nanopinnar, att de växte uppe på pinnarnas spetsar. Med hjälp av konfokal-mikroskopi kunde alla rörelser, inducerade av cellulära krafter, hos pinnspetsarna observeras. Från balkteori och piezoelektriska mätningar av nanopinnarnas böjstyvhet, kunde de cellulära krafterna beräknas. Krafter ända ner mot tiotals picoNewton kunde detekteras, med mindre än en mikrometer mellan mätpunkterna. Inte bara de dynamiska krafternas storlekar, utan också deras riktningar, kunde mätas med god tidsupplösning.



Nanotuber

Nanopinnar omgjorda till nanotuber kan användas i experiment som syftar till att injicera molekyler direkt in i levande celler. Sådana nanotuber tillverkades från pinnar av galliumarsenid (GaAs) genom att nanopinnarnas sidor täcktes med aluminiumoxid, atomlager för atomlager. Ytan belades dessutom med en polymer i vilken nanotuberna skulle vara upphängda sedan deras substrat etsats bort. Därefter täcktes hela ytan tillfälligt med ett skyddande plastskikt, innan nanopinnarnas toppar kunde skrapas av och innanmätet etsas bort. Ett hål på substratets baksida användes för att komma åt tuberna, som nu bara bars upp av det tunna polymer-membranet. På detta vis hade grupper av 70 nm-hål framställts, genom ett ursprungligen flera hundra μm tjockt halvledarsubstrat. Till skillnad från andra existerande nanopor-membran, så hade dessa ”hål” formen av rör som stack upp flera μm över ytan. De kunde därför användas till att penetrera levande celler för att injicera material i dem. Försök utan celler visade att till och med stora DNA-strängar kunde dras genom tuberna med hjälp av ett elektriskt fält. Försök med celler antydde att fluorescenta molekyler som normalt inte tränger in i levande celler kunde ta sig in i cellerna via tuberna. Vidare studier visade att sådana tuber till och med kunde tränga in i kärnan på celler utan att direkt döda dem – ett lovande resultat för fortsatta nanoinjektionsförsök.



Den eventuella faran med nanopartiklar

Den snabbt växande nanoteknologin skapar en allt större mängd av nanopartiklar av vilka en andel kan leta sig ut i naturen eller in i människor. Eftersom dessa partiklar aldrig existerat tidigare är det viktigt att undersöka vilka effekter de kan få på organismer och ekosystem. I en första studie undersöktes hur makrofager, den slags vita blodkroppar som normalt ansvarar för renhållningen från främmande partiklar i kroppen, reagerade på nanopinnar av olika storlek och material. Det finns ännu ingen klar bild av den eventuella skadligheten hos olika sorters nanostrukturer, men två faktorer som kan ha betydelse för makrofagernas förmåga att konsumera strukturerna är dels att de upptäcks av cellerna och dels att de inte är för långsmala för att få plats i en cell. Det senare är exempelvis ofta fallet med asbestfibrer, och är ett av skälen till att de gör så stor skada i lungorna. Förutom GaP-pinnar undersöktes pinnar av nickel, guld och polystyren – en hårdplast använd till odlingsskålar. De tre sistnämnda pinntyperna producerades med olika tekniker i aluminiumfilter som senare etsades bort. De var samtliga tjockare (200 nm) och längre (5–60 μm) än halvledarpinnarna (50 nm och 2,5 μm). Studien visade att samtliga pinntyper raskt identifierades och slukades av makrofagerna. De små korta GaP-pinnarna kunde alltid internaliseras, medan långa nickelpinnar kunde ställa till problem för cellerna. Tillsatserna av nanopinnar orsakade ökad celldöd hos makrofagerna, mest så i nickelfallet och minst från polystyrenet. GaP-pinnarna hade en verkan någonstans däremellan.



Sammanfattningsvis

Sammantaget visar dessa studier tydligt att man kan skapa en mängd intressanta interaktioner mellan nanopinnar och levande celler, och att dessa interaktioner kan användas för olika tillämpningar. Tillämpningarna som beskrivs här är olika exempel på subcellulär påverkan, där nanoteknologins möjligheter till fantastisk spatial upplösning utnyttjas. De är bara ett par exempel av vad som är möjligt, och är alla baserade på nanopinnarnas topografiska karaktär – att de är långa, smala och vertikala. Mer avancerade system, där även elektriska, optiska och kemiska egenskaper utnyttjas är fullt möjliga i framtiden. Genom möjligheten att i detalj studera och påverka stora mängder av celler parallellt kan kristallina nanopinnar ta cellforskningen till verkligt subcellulära nivåer.

• author: Hällström, Waldemar
• supervisor: Lars Samuelson
• opponent: Professor Lee, Luke, University of California, Berkeley, USA
• organization: Solid State Physics; Nanometer structure consortium (nmC)-lup-obsolete (research group); NanoLund: Centre for Nanoscience
• publishing date: 2010
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Engineering and Technology
• keywords: Nanotoxicology, Nanowires, Nanotubes, Nerve Cells, Cell Probing, Force Measurements, Nanotechnology, Axonal Guidance, Fysicumarkivet A:2010:Hällström
• pages: 208 pages
• defense location: Hörsal B, Fysiska institutionen, Sölvegatan 14, Lunds Universitet, Lunds Tekniska Högskola
• defense date: 2010-04-23 13:15:00
• ISBN: 978-91-628-8070-5
• language: English
• LU publication?: yes
• id: ef1bddbf-4249-4441-ba0e-5071c60072ac (old id 1580877)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:38:05
• date last changed: 2019-07-05 09:30:03