Health Promoting Effects of Bioactive Peptides in Milk - Studies on Cultured Normal Cells and Cancer Cells

Abstract

This thesis concerns the bioactive peptides lactoferricin and ubiquitin and findings suggesting that they have ability to modify the risk of cancer. It is known that components in bovine milk may improve human health and modify the risk of diseases. Examples of such compounds are bioactive peptides, i.e. peptides with an effect on the body beyond the purely nutritional.

Using cell culture as a model system possible cancer preventing effects were investigated with focus on cell proliferation, cell death and DNA repair. In one study, the effect of lactoferricin on CaCo-2 human colon cancer cells was investigated. Low concentrations of the peptide, equivalent to the amount released in the gut of a milk consumer, were used to study the effects during several weeks. A decreased proliferation rate was observed in cancer cells, raising the hypothesis that a prolongation of the cell cycle may be beneficial for the DNA repair system in normal cells. To test this, the effect of lactoferricin treatment was studied in a normal colon cell line. Lactoferricin treatment resulted in decreased proliferation and decreased levels of G1 and S phase proteins. In another study we induced DNA damage in CaCo-2 cells by exposure to UV-light and allowing them to grow in the absence or presence of lactoferricin. The measurement of DNA damage, as detected by the alkaline Comet assay,

showed that cells treated with lactoferricin had less DNA damage than the control cells. Another part of the work was to identify new bioactive peptides in milk. Using quantitative Western blot and peptide mass fingerprinting techniques we found that the peptide ubiquitin is

present in milk in low concentrations. The effect of ubiquitin on cell proliferation and protein expression was examined both in CaCo-2 cells and in two neuroblastoma cell lines, SH-SY5Y and LA-N-1. Ubiquitin treatment decreased the cell proliferation rate in CaCo-2 and SH-SY5Y cells. LA-N-1 cells initially responded to the ubiquitin treatment with a decreased

proliferation rate but after almost three weeks of treatment an alteration in the growth pattern took place and the treated cells grew faster than the control cells. The cell proliferative effects correlated with the level of ubiquitination of intracellular proteins observed in respective cell

line. The results showed that the effects of lactoferricin and ubiquitin on cell proliferation may contribute to the health promoting effects of milk.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Mjölk och mjölkprodukter har länge varit en viktig del av vår föda. Studier som undersöker förekomst av sjukdomar i olika befolkningsgrupper och vilka faktorer som påverkar dessa, så kallade epidemiologiska studier, har visat på ett samband mellan mjölkdrickande och minskad risk för flera cancerformer, bland andra tjocktarmscancer. Man vet att kalciumhalten i mjölk till stor del bidrar till detta samband, men alla mekanismer bakom mjölkens hälsofrämjande egenskaper är inte klarlagda. Vår hypotes var att svaret till viss del ligger hos peptider, småbitar av proteiner, som visat sig ha positiva effekter för hälsan. Dessa peptider som har en effekt på kroppen, utöver den rent näringsmässiga, kallas bioaktiva peptider. Bioaktiva peptider kan finnas fria i mjölken eller frigöras vid livsmedelsprocessning eller när proteiner bryts ned i mag-tarmkanalen.



De flesta av kroppens celler delar sig, även om det sker olika ofta i olika organ. Hos normala celler är detta en strikt reglerad process men i cancerceller är regleringen satt ur spel och celldelning sker ohämmat. Cancer initieras av skador (mutationer) på de gener som styr normal celltillväxt och celldöd. Eftersom DNA-skador ackumuleras under celldelningen, innebär varje celldelning en liten risk för mutationer som leder till cancer. Cancer orsakar sju miljoner dödsfall i världen varje år och innebär en stor kostnad för samhället. Trots mångårig forskning är dödligheten inom flera cancerformer hög och behovet av nya behandlingsformer

är fortfarande stort. Att genom ändrad diet ha möjlighet att minska risken att drabbas av cancer eller andra allvarliga sjukdomar skulle innebära en stor vinst både för individen och för samhället.



För alla studier presenterade i avhandlingen användes humana cellinjer som modellsystem för att studera effekten av bioaktiva mjölkpeptider framför allt på celldelning. Den ökade förståelsen vi uppnår när det gäller mjölkpeptiders hälsofrämjande effekter kan vara en viktig utgångspunkt för vidare forskning och utveckling av nya ”functional foods” eller läkemedel

för cancerbehandling.



Processen när en cell växer, delar sig och blir till två identiska dotterceller kallas för cellcykeln. Cellcykeln styrs av en mängd olika reglerande proteiner och är uppdelad i olika faser. Inför varje ny fas finns strängt styrda kontrollpunkter där cellen kontrollerar att allt är

redo innan den går vidare till nästa steg. Om inte cellen uppfyller kraven för att passera kontrollpunkten, kan den antingen genomgå nödvändiga reparationer eller, om skadorna är för allvarliga, gå in i apoptos, programmerad celldöd. Vad som sker med en cell vid kontrollpunkterna kan liknas vid en bil på bilbesiktning. Antingen går den genom utan problem, eller också krävs vissa reparationer för att få fortsätta köra. I värsta fall, om skadorna inte går att reparera, skrotas cellen. Och liksom med bilar, ökar risken för skador med åldern.



I slutet av cellcykeln innehåller cellerna dubbelt så mycket DNA som i början. Genom att märka in DNA med ett fluorescerande ämne kan man avgöra var någonstans i cellcykeln cellerna befinner sig. Med hjälp av detta kan man också bestämma längden på cellcykeln och på de olika faserna. Laktoferricin är en bioaktiv peptid, som frigörs vid nedbrytning av

mjölkproteinet laktoferrin i tarmen. Vi började med att undersöka vad som hände i tjocktarmscancerceller från människor som odlades med eller utan laktoferricin. Det visade sig att lactoferricin förlängde S-fasen, den fas i cellcykeln där kromosomerna fördubblas. En koncentration av lactoferricin motsvarande den mängd som frigörs i tarmen när du dricker två liter mjölk förlängde S-fasen hos tjocktarmscancerceller med 10 procent jämfört med kontroll efter odling i två dagar. Detta resultat bekräftades ytterligare av minskat uttryck av cyklin E1, ett protein som reglerar cellcykelns förlopp. För att studera effekten av laktoferricin under fler celldelningar odlades tjocktarmscancercellerna i fem veckor med lactoferricin. Resultatet

visade att den långsammare celldelningen ledde till signifikant minskad tillväxthastighet vid längre tids behandling.



Parallellt med lactoferricin-studierna började vi jakten på ännu okända peptider i mjölk. För att identifiera nya peptider använde vi en metod som bygger på storleksseparation av protein och peptider, följt av identifiering baserad på en jämförelse av peptidernas massa mot en databas med kända peptidmassor. På detta sätt identifierade vi ubiquitin i komjölk. Vi gjorde även en uppskattning av ubiquitin-koncentrationen i mjölk. Effekten av ubiquitin undersöktes i tjocktarmscancercellerna och också ubiquitin visade sig minska celldelningshastigheten. Effekten av ubiquitin studerades även i neuroblastomceller, en cancerform som främst drabbar barn. Vi undersökte två olika neuroblastomcellinjer, en med karaktären hos tumörer med goda möjligheter att bli frisk, och en med karaktären hos tumörer med sämre diagnos för patienten. Den initiala effekten var den samma för båda neuroblastomcellinjerna, men efter halva behandlingstiden avtog effekten för cellerna med sämre tumör och efter fem veckor växte de i samma takt som de obehandlade kontrollcellerna. För cellerna med bättre diagnos fortsatte tillväxthastigheten avta under hela behandlingen. Den mesta välkända funktionen av ubiquitin är att den sätter sig på proteiner som en signal att proteinet ska brytas ned. Detta fenomen är en viktig del i nästan alla cellens funktioner. Vi såg att det fanns mycket ubiquitin på proteiner i neuroblastomceller med god prognos som behandlats med ubiquitin men väldigt lite på proteinerna i cellerna med sämre diagnos. Detta tror vi har ett samband med uttrycket av en receptor som fanns på ytan av cellerna med god prognos och som andra har förslagit kan interagera med ubiquitin.



Genom att utsätta celler för ultraviolett strålning kan man skapa DNA-skador, som kan starta cancerförloppet i en cell. För att se vad som händer i cellerna vid uppkomst och reparation av DNA-skada, bestrålades tjocktarmscancerceller med ultraviolett ljus och sedan fick de växa

vidare med eller utan laktoferricin. En metod som kallas ”Comet assay” kan användas för att titta på mängden DNA-skada i cellerna. Namnet på metoden kommer från att celler med skadat DNA ser ut som en komet med svans. Längden på kometen svans är ett mått på DNAskadans omfattning och oskadda celler har ingen svans alls. Våra studier visar att mängden DNA-skada var mindre hos de celler som behandlats med laktoferricin efter ultraviolett

strålning än hos de celler som fått växa utan laktoferricin.



Med utgångspunkt i våra tidigare resultat studerade vi även hur bioaktiva peptider påverkar en normal tarmcellinje. De normala tarmcellerna reagerade på behandlingen på samma sätt som tjocktarmscancercellerna, även om det tog fler celldelningar innan effekten av peptiderna blev tillräckligt stor för att vara statistiskt säkerställd. Båda lactoferricin och ubiquitin minskade

celldelningshastigheten hos normala tarmceller vid behandling över flera veckor. Den minskade celldelningshastigheten kan göra att cellerna får mer tid att hitta och reparera DNAskador, något som i sin tur kan leda till minskad risk att drabbas av cancer. Skillnaderna vi ser är knappt märkbara över en eller två celldelningar, men kan ha stor betydelse över lång tid.

Hälsosamma mat- och dryckesval dagligen kan avgöra din hälsa under en livstid. Ett glas mjölk om dagen kan vara nog för att minska risken att drabbas av tjocktarmscancer.

• author: Freiburghaus, Catja
• supervisor: Marie Paulsson; Stina Oredsson; Helena Lindmark Månsson
• opponent: Ass Proferssor Rasmussen, Jan Trige, Department of Molecular Biology, Aarhus University, Aarhus, Denmark
• organization: Department of Food Technology, Engineering and Nutrition
• publishing date: 2010
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Food Engineering
• pages: 154 pages
• defense location: Lecture Hall C, Centre for Chemistry and Chemical Engineering, Getingevägen 60, Lund University Faculty of Engineering
• defense date: 2010-12-10 09:00:00
• ISBN: 978-91-7473-036-4
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 8d8d2929-3d76-4292-96dd-7fdd57c1c50c (old id 1716617)
• date added to LUP: 2016-04-04 13:54:06
• date last changed: 2024-01-30 10:28:42