EGF-like modules in blood coagulation proteins : Ca²+ binding, module interactions, structure and dynamics as studied by NMR spectroscopy

Abstract

Modules are independently folding protein domains defined on the gene level. The epidermal growth factor-like (EGF) modules are involved in protein-protein interactions and are found in numerous membrane proteins and extracellular proteins, including many proteins of the blood coagulation system. A subset of the EGF modules binds one Ca²⁺ with an affinity that is often influenced by the neighbouring module on the N-terminal side.



The complex of factor VIIa (FVIIa) and tissue factor (TF) is important for the initiation of blood coagulation. Reports in the literature suggest that Ca²⁺ binding to the N-terminal EGF module (EGF 1) of FVIIa is essential for the complex to form. We determined the structure of the Ca²⁺-free EGF 1 using NMR spectroscopy. Comparison of this structure with that of the Ca²⁺-bound EGF 1 in the structure of the TF:FVIIa complex shows that only small conformational changes take place as a result of Ca²⁺ binding. These observations are consistent with the view that the Ca²⁺ binding to EGF 1 is crucial for a well-defined, relative orientation of the Gla and EGF 1 modules, which enables the formation of a high-affinity TF:FVIIa complex.



Anticoagulant protein S has four EGF modules. The three C-terminal bind Ca²⁺ with high affinity. The fragment constituting the EGF 3-4 module pair from protein S (pS EGF 3-4) is the smallest fragment that retains high-affinity Ca²⁺ binding. The <i>K</i>_d for Ca²⁺ binding was determined to be 4.8 millimolar and 1.0 micromolar for EGF 3 and EGF 4, respectively. Thus the Ca²⁺ affinity of the N-terminal site was similar to that of the isolated EGF 3, while the affinity of EGF 4 in pS EGF 3-4 was approximately 9000-fold higher than that of the isolated EGF 4. The ¹H, ¹⁵N, ¹³CA and ¹³CB resonances of the module pair were assigned using multidimensional heteronuclear NMR spectroscopy. The effect of Ca²⁺ binding on individual resonances was studied. Apart from extensive shift effects of resonances close to the Ca²⁺-binding site, we observed shift effects far from the expected location of the binding site in each of the modules.



Extensive spectral heterogeneity revealed <i>cis-trans</i> isomerisation at a very slow rate (<i>k</i>_ex < 0.2 s^-1) of the Lys 167-Pro 168 peptide bond or, possibly, trapping of the two conformers in the folding process. Both conformers have similar Ca²⁺ affinities and backbone dynamics. ¹⁵N spin relaxation data suggested that the module pair with one Ca²⁺ bound in EGF 4 has a well-defined relative orientation between EGF modules 3 and 4. In the absence of Ca²⁺, broadening of several resonances in EGF 4 suggests that chemical exchange is taking place. This is probably not consistent with a well-defined module interface. A comparison of residual dipolar couplings measured on a partly aligned pS EGF 3-4 sample with couplings calculated from the known structure of an EGF module pair from fibrillin-1 suggested that the two EGF modules of pS EGF 3-4 are oriented at an angle of approximately 90 º rather than being oriented in a rod-like arrangement (180 º) as in the fibrillin-1 EGF module pair.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

I avhandlingen presenteras resultaten från studier av EGF-moduler från blodkoagulationsproteiner. Dessa studier har utförts med högupplösande kärnmagnetisk resonansspektroskopi. Resultaten av studierna återges i denna populärvetenskapliga sammanfattning. Som bakgrund ges inledningsvis en introduktion till den grundläggande biologin och den teknik som använts i studierna.



Proteiner är livsviktiga molekyler i alla levande organismer, från bakterier och virus till människor och andra däggdjur. Proteiner är långa kedjor uppbyggda av 20 distinkta aminosyror. Aminosyrornas ordningsföljd, aminosyrasekvensen, bestäms av arvsmassan, DNA, som finns lagrad i varje cell som en organism är uppbyggd av. Aminosyrorna har två delar. Den ena delen utgör ryggraden som används för att hålla samman kedjan och som är lika i alla typer av aminosyror. Den andra delen utgör en sidokedja, som är unik för varje typ av aminosyra. Till exempel har vissa aminosyror en sidokedja som skyr vatten (hydrofob) och därför tycker om en miljö där den har kontakt med andra hydrofoba sidokedjor. Andra sidokedjor vill hellre vara i en vattenmiljö (hydrofila). Proteinkedjan veckar sig till en unik struktur, bestämd av aminosyrasekvensen. Hur strukturen ser ut bestäms genom att varje sidokedja hittar den mest lämpliga miljön att vara i. De hydrofoba sidokedjorna samlar sig i proteinets inre, medan de hydrofila sidokedjorna pekar utåt. I princip kommer alla exemplar av ett specifikt protein att få samma unika struktur när de veckats.



Varje protein har en eller flera funktioner. Till exempel är proteinet hemoglobin ansvarigt för att transportera syre från lungorna via blodet till celler i hela kroppen. Proteinet trypsin finns i magsäcken och spjälkar proteiner som finns i födan till mindre enheter, som kan användas som energi i kroppen. Hemoglobin och trypsin är exempel på proteiner som finns utanför cellerna, extracellulära proteiner, men det finns också många proteiner inne i cellerna, intracellulära proteiner. Dessa proteiner kan till exempel ha som funktion att reglera hur mycket av ett visst protein som ska tillverkas i en cell.



I avhandlingen har proteiner som ingår i blodkoagulationssystemet studerats. Detta system är ansvarigt för att stoppa blödningar. I korthet går det till så att när ett blodkärl skadas aktiveras ett antal proteiner som normalt cirkulerar i blodet i en inaktiv form. Aktiveringen, som sker direkt efter att skadan uppkommit, förstärks kraftigt genom samverkan mellan flera olika proteiner (s. 9, Fig. 3). Det önskade resultatet är att skadan täpps till av en plugg, som framförallt består av blodplättar och proteinet fibrin. Därmed stoppas utflödet av blod och läkningen av vävnaden runt skadan kan börja. För att pluggen inte ska bli för stor eller sprida sig till oskadade blodkärl finns ett motverkande system, antikoagulationssystemet. Det är av yttersta vikt att blodkoagulations- och antikoagulationssystemen är i balans. Om egenskapen att koagulera blodet är för svag kan det leda till att blödningar inte kan stoppas effektivt. En individ som har denna obalans lider av blödarsjuka (hemofili). Om istället antikoagulationen inte är tillräckligt effektiv kan oönskad koagulering leda till en ökad risk för blodproppar (trombofili). Obalans i dessa system kan förorsakas av en eller flera mutationer i generna (DNA), som bestämmer vilken aminosyrasekvens proteinerna ska få. En mutation i en gen kan till exempel innebära att fel typ av aminosyra inkorporeras i en specifik position i ett protein.



För att förstå dessa sjukdomar och komma på hur de kan lindras är det viktigt att förstå den normala funktionen av proteinerna som ingår i blodkoagulations- och antikoagulationssystemen och vad som sker när mutationer leder till att onormala proteiner produceras.



Proteiner är små och för att studera dem krävs speciella metoder. En mycket användbar och mångfacetterad metod är kärnmagnetisk resonansspektroskopi. Denna teknik, som ofta benämns NMR-spektroskopi efter det engelska namnet för tekniken, Nuclear Magnetic Resonance, bygger på en egenskap hos atomkärnan som kallas kärnspinn. Det är svårt att beskriva vad spinn är eftersom det är en egenskap som finns hos väldigt små partiklar som atomkärnor och elektroner, men som saknas i vår makroskopiska värld. Låt oss bara anta att det är en egenskap hos atomkärnan precis som massa eller laddning. Det intressanta med kärnspinnet är att vi kan använda det som en liten spion som sitter inuti proteinmolekylen. Med rätt metoder kan vi få denna spion att rapportera om sin närmaste omgivning, om avstånd till andra atomer och om hur atomen rör sig i förhållande till de andra atomerna i molekylen. Det går till så att proteinet placeras i ett mycket starkt magnetfält i vilket kärnspinnen är mottagliga för påverkan av radiosignaler. De svarar på denna påverkan genom att själva sända ut radiosignaler som kan detekteras och omvandlas till ett NMR-spektrum (s. 44, Fig. 12 och s. 47, Fig. 13). Genom att kombinera radiosignalerna i experimentet på olika sätt kan vi välja vilken typ av information som ska rapporteras i spektrumet.



Det finns en begränsning för hur stora proteinerna kan vara för att de ska kunna studeras med NMR-spektroskopi. Om proteinet man vill studera är för stort kan man under vissa omständigheter välja att bara studera en specifik del av proteinet. Vissa proteiner är sammansatta av moduler, som är segment av aminosyrasekvensen som veckas i en individuell enhet. Även om resten av proteinet tas bort kan segmentet som utgör en modul veckas till en struktur som i allmänhet är mycket lik den struktur som modulen skulle ha haft i det intakta proteinet. De flesta proteinerna i blodkoagulationssystemet är av den modulära typen och kan därför delas upp i mindre bitar, moduler, som kan studeras separat (s. 5, Fig. 2). Flera blodkoagulationsproteiner och många andra extracellulära proteiner innehåller en typ av modul som kallas EGF-modul.



Interaktionen mellan de två blodkoagulationsproteinerna faktor VII och vävnadsfaktor (VF) är viktig för att blodkoagulationsprocessen ska starta. VF är normalt inte i kontakt med blodet. Först när kärlväggen gått sönder kommer VF i kontakt med blodet där faktor VII återfinns. Tidigare studier har visat att denna interaktion kräver att en kalciumjon binds till en av EGF-modulerna i faktor VII. För att utröna vilken roll kalciumjonen har i interaktionen studerade vi denna EGF-modul från faktor VII (totalt 41 aminosyror) (Paper I, Fig. 1) utan bunden kalciumjon. Genom att jämföra vår struktur av den kalciumfria EGF-modulen med en struktur i vilken kalciumjonen var bunden till EGF-modulen kunde vi fastslå att kalciumjonen inte nämnvärt påverkar EGF-modulens struktur och på det sättet underlättar interaktionen mellan faktor VII och VF (Paper I, Fig. 4-7). Snarare påverkar kalciumjonen orienteringen mellan EGF-modulen och grannmodulen på ett sådant sätt att dessa får en välbestämd orientering relativt varandra, vilket gör det möjligt för faktor VII att bindas till VF.



I de övriga arbetena som utgör avhandlingen har vi studerat två sammanhängande EGF-moduler, EGF 3 och EGF 4 (totalt 89 aminosyror) (Paper II, Fig. 1), från antikoagulationsproteinet protein S. Även dessa två EGF-moduler binder kalcium. Vi mätte hur starkt de två modulerna i modulparet binder kalcium och fann att EGF 4 binder kalcium 5000 gånger starkare än EGF 3. Dessutom binder EGF 4 i modulparet kalcium 9000 gånger starkare än vad en isolerad EGF 4 modul gör. Dessa resultat visar att modulerna i protein S inte är oberoende av varandra, utan att en EGF-modul kraftigt påverkar kalciumbindningen till nästföljande EGF-modul.



Vi kunde visa att strukturen av varje EGF-modul i modulparet liknar de strukturer av EGF-moduler från andra proteiner som tidigare har publicerats (Paper III, Fig. 3).



NMR-tekniken gjorde det också möjligt att studera hur inbindningen av kalcium påverkar varje enskild aminosyra i proteinet (Paper IV, Fig. 7-9). Förutom lokala effekter precis där kalciumjonen binder in såg vi, framför allt i EGF 4, effekter som sträcker sig över nästan alla aminosyror i den modulen (Paper IV, Fig 8A).



Genom att utföra experiment som är känsliga för rörelsen hos de enskilda kärnspinnen kunde vi konstatera att när en kalciumjon är bunden till EGF 4 utgör länken mellan de två EGF-modulerna en av de stabilaste delarna av EGF-modulparet (Paper IV, Fig. 11). Det betyder förmodligen att kalciumjonen påverkar interaktionen mellan de två EGF-modulerna.



Kalciumbindningen till EGF 4 är mycket starkare än vad som rapporterats för något annat protein som innehåller EGF-moduler (Paper IV, Fig 2). Vi ville utröna om detta kunde vara relaterat till att den relativa orienteringen av EGF 4 och den föregående modulen, EGF 3, kunde vara annorlunda jämfört med strukturen av ett liknande protein med mycket lägre kalciumbindningsaffinitet. Strukturen av ett EGF-modulpar från ett protein kallat fibrillin-1 har publicerats. I den strukturen är EGF-modulerna orienterade så att proteinet är utsträckt och modulerna följdaktligen ligger i en rät linje. I stället för att göra en fullständig strukturbestämning av protein S EGF 3-4, vilket är väldigt mödosamt och tidskrävande, mätte och analyserade vi en NMR-parameter kallad den dipolära kopplingen som är lätt att mäta men endast ger begränsad information om proteinets struktur. Slutsatsen blev att EGF-modulerna i modulparet EGF 3-4 från protein S har en helt annan orientering, där EGF-modulerna är orienterade i 90 º vinkel till varandra (Paper V, Fig. 4). Kanske leder denna orientering till att den bundna kalciumjonen ligger väl skyddad och inte så gärna lämnar proteinet, vilket skulle vara förenligt med en hög kalciumbindningsaffinitet.

• author: Muranyi, Andreas
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Baleja, James D., Tufts University School of Medicine, Boston, Massachusetts, USA
• organization: Biophysical Chemistry
• publishing date: 2000
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Physical Chemistry
• keywords: residual dipolar couplings, protein S, factor VII, protein structure, calcium, blood coagulation, NMR spectroscopy, EGF modules, Physical chemistry, Fysikalisk kemi
• pages: 183 pages
• defense location: Hörsal B, Kemicentrum, Getingev. 60, Lund
• defense date: 2000-05-19 13:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUTKDH/TKFK--00/1010--SE
• ISBN: 91-628-4159-9
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 1bca5ddb-e524-47a2-922f-ad622d56eee6 (old id 19664)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:21:29
• date last changed: 2018-11-21 21:04:19