To Fold or To Fibrillate? Serendipity in Stability Studies

Abstract

Proteins are complex structures and years of research have been spent on attempts to understand their complexity. The non-covalent interactions involved in protein folding are: hydrophobic effect, electrostatic interactions, van der Waals interactions and hydrogen bonding. It has been of great interest to address the importance of each of those interactions in proteins. While hydrophobic effect is believed to play the major role in protein folding, Coulombic interactions are of importance in for example protein function, specificity, kinetics and avoidance of unspecific association. Proteins, which are usually folded under native conditions, may also enter other conformations, for example amyloid structures, upon changes in the intrinsic and extrinsic factors.



The general objective of this thesis was to study the interplay of the non-covalent interactions in protein folding, assembly and aggregation processes. We found a correlation between stability and assembly of mutants of monellin which implies that the same non-covalent interactions govern the two processes. We also found that the net charge of monellin is important in order to bind to its receptor. In order to stabilize the protein PGB1, we used the split GFP method and selected mutants with elevated melting temperatures by as much as 12˚C. Another series of monellin mutants revealed a correlation between stability and aggregation lag time. In the same study a correlation between predicted aggregation propensity and aggregation lag time was found. We also investigated how terminal extensions of the amino acid sequence affected the aggregation properties of Alzheimer´s β-peptide (Aβ) and found that addition of non-aggregating sequence decreases the aggregation rate of this peptide.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Det finns tre typer av makromolekyler som är grundläggande för allt liv på jorden: DNA, RNA och proteiner. I varje cell i kroppen finns en kopia av vår arvsmassa, DNA. Denna består av gener som avkodas först till RNA och sedan till tiotusentals proteiner. Alla gener är inte aktiva i varje cell eller i varje tidpunkt. Proteiner kontrollerar nästan alla aspekter av det vi kallar liv. De transporterar syre, bygger upp vävnad, extraherar energi ur den föda vi äter, signalerar mellan och i celler och skyddar oss mot sjukdomar. Blir det fel på ett protein så kan det leda till sjukdomar som t.ex. diabetes, där proteinet insulin produceras i för liten mängd, eller Alzheimers som orsakas av att ett litet protein faller ut i hjärnan. Det är därför av stor vikt att studera olika proteiner och försöka förstå dess komplexa natur.

Man kan tänka sig att ett protein är som ett halsband av pärlor (aminosyror) med olika egenskaper. Det finns 20 olika sorters pärlor; de kan vara stora, små, runda, asymmetriska, blanka och/eller matta. Om du håller ett halsband i din näve så veckar det ihop sig till ett nystan. På samma sätt veckar sig ett protein till en kompakt struktur i vatten. Aminosyror som inte trivs i vatten samlas i mitten av strukturen medan de aminosyrorna som gillar vatten hamnar på ytan av proteinet. Proteinet får gynnsamma interaktioner (entalpivinst) när den veckas men förlorar samtidigt i antal konformationer som det kan anta (entropiförlust). Proteinets entalpi och entropi bestämmer dess stabilitet, det vill säga hur bra strukturen håller ihop. Den unika ordningen av aminosyrorna (pärlorna) i varje protein bestämmer hur proteinet kommer att veckas och vilken biologisk funktion proteinet får. Även om man känner till vilka aminosyror som ingår i ett protein så är det svårt att förutse hur proteinet kommer att veckas. Vecknings-processen kan också påverkas av yttre faktorer och resultera i att proteinet antar fel struktur som kan vara sjukdomsalstrande.

Ett sätt att öka förståelsen om interaktionerna i ett protein är genom att byta ut (mutera) en eller flera aminosyror i det och se vilken effekt det har på proteinets (mutantens) struktur och stabilitet.



I denna avhandling sammanfattar jag resultaten från fem olika studier. Jag har tillsammans med andra forskare undersökt hur olika mutationer påverkar några proteiners egenskaper. I tre av studierna användes proteinet monellin (artikel I, II och IV). Monellin är ett protein som kommer från ett bär i Ghana. Det binder till samma smakreceptor på tungan som vanligt socker men binder mycket starkare och ger upphov till längre söthetsupplevelse. Sockermolekylerna lossnar snabbt från receptorn vilket innebär att smakupplevelsen blir kortvarig. Det behövs hundra tusen fler sockermolekyler för att få samma söthetsupplevelse som från en enda monellinmolekyl. Monellin består naturligt av två proteinkedjor, A och B, som hålls ihop av interaktioner mellan dem.

Vi har tittat på olika mutanter av monellin för att se hur laddningen på proteinet påverkar dess egenskaper så som stabilitet, ihopbindning och söthet. Vi fann att interaktionerna mellan de två fragmenten A och B kunde korreleras till interaktionerna som håller ihop (stabiliserar) proteinet när A och B är sammankopplade till en kedja (artikel I). Detta kan utnyttjas när man vill studera proteinets stabilitet. Istället för att använda denatureringsmedel för att mäta när proteinet tappar sin struktur och därmed denatureras kan man titta på hur starkt de två fragmenten binder till varandra och därifrån förutse effekterna på dess stabilitet. När vi undersökte sötheten hos monellinmutanter fann vi att det är viktigt med en positiv laddning hos monellin för att det ska ge en söt smak (artikel II). Söthetsreceptorerna på tungan är negativt laddade och det kan vara anledningen till att en mutant av monellin som är positivt laddad binder till en receptor bättre än en mutant som är negativt laddad.

Fager är ofarliga virus och man kan få dem till att visa upp ett önskat protein. Ett fag-bibliotek är många fager som visar upp var sin mutant av ett protein. Mutanter med specifika egenskaper kan fiskas ut ur biblioteket. Vi framställde ett fag-bibliotek av monellinmutanter i syfte att hitta mutanter med högre stabilitet. De utfiskade mutanterna visade sig istället vara aggregeringsbenägna och vi undersökte korrelationen mellan aggregeringsbenägenheten och stabiliteten. Det visade sig att ju lägre stabilitet en mutant hade desto mer aggregeringsbenägen var den (artikel IV). Eftersom vi i denna studie fiskade ut mutanter på andra grunder än stabilitet bytte vi till en annan metod som heter ”delad GFP” för att försöka hitta stabilare mutanter av ett protein. GFP är ett protein som lyser grönt när det är veckat. Om man delar detta protein i två bitar så lyckas bitarna inte att binda ihop och få sin färg. Om man kopplar två fragment av ett annat protein som kan binda starkt till varandra gör man det också möjligt för fragmenten av GFP att binda ihop och få sin gröna färg. Vi lyckades att stabilisera modellproteinet PGB1 med denna metod (artikel III).

Efter att ha kommit i kontakt med aggregerande proteiner i studie IV ville jag fortsätta med att studera något aggregerande protein från människa och valde Amyloid beta peptiden (Aβ) som är inblandad i Alzheimers sjukdom. Jag undersökte hur olika förlängningar av denna peptid påverkade dess aggregeringshastighet och fann en korrelation mellan längden av det extra fragmentet och aggregeringshastigheten. Ju längre förlängningen är desto bättre skyddar den mot aggregering. Detta tyder på att en förlängning med icke-aggregerande sekvens försvårar själva aggregeringsprocessen. (artikel V).



Studierna i denna avhandling har ökat vår förståelse av hur proteiner interagerar inom sig själva och att dessa interaktioner ofta är starka nog för att hålla ihop ett protein även om det delas i två separata fragment. Samma slags interaktioner verkar mellan proteiner och vi fann att laddning av olika proteiner har betydelse för hur två proteiner interagerar med varandra. Vi har också studerat förloppet då ett protein bildar aggregat istället för den veckade strukturen och fann att ett protein som innehåller aggregeringsbenägna segment kan skyddas av andra delar av sin sekvens som inte är aggregeringsbenägna.



Det är fortfarande en utmaning att förstå det komplexa samspelet mellan alla interaktioner i och mellan proteiner och mycket spännande forskning återstår!

• author: Szczepankiewicz, Olga
• supervisor: Sara Linse
• opponent: Prof. Otzen, Daniel, University of Aarhus, Aarhus, Danmark
• organization: Biophysical Chemistry; NanoLund: Centre for Nanoscience
• publishing date: 2011
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Physical Chemistry
• keywords: Protein stability, protein reconstitution, protein aggregation, Monellin, PGB1, Split-GFP, Amyloid beta
• defense location: Lecture hall B, Center of Chemistry and Chemical Engineering, Lund University Faculty of Engineering
• defense date: 2011-10-28 13:00:00
• ISBN: 978-91-7422-280-7
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 64040315-9a59-4aa3-8198-678ad6c9cd08 (old id 2169882)
• date added to LUP: 2016-04-04 14:15:49
• date last changed: 2018-11-21 22:51:15