Enzymatic hydrolysis coupled to hot water extraction for determination of flavonoids in plants

Abstract

The word sustainability is more and more frequently used within the field of chemistry and in many other fields. Green or sustainable chemistry was introduced during the 90 ́s as a field of chemistry where the environmental and health impacts of processes and products are evaluated and improved. Within analytical chemistry the awareness of sustainability has also increased, which has resulted in optimisation and development of new techniques and methods.

The easiest way to improve the sustainability of an analytical method is to decrease and/or replace the use of hazardous chemicals with ones known to have less negative impact on the environment. This thesis reports on a study of the extraction and hydrolysis of quercetin glucosides from onion using sustainable solvents and catalysts. Water at elevated temperatures has been used as a green extraction solvent and, to catalyse the hydrolysis reaction, a thermostable beta-glucosidase expressed from Thermotoga neapolitana, TnBgl1A has been used. It is shown that the use of water as extraction solvent and enzyme as catalyst have less environmental impact than the conventional method where aqueous methanol and a high concentration of HCl are used as extraction solvent and catalyst, respectively.

In studying the rate of hydrolysis, it was found that glucose bound at the 3-position of quercetin was slower to hydrolyse than glucose bound at 4 ́-position when TnBgl1A was used as catalyst. Different amino acids in the active site of TnBgl1A were mutated and one mutant, TnBgl1A_N221S/P342L, showed an increased hydrolysis rate of glucose at 4 ́-position, but also of glucose at 3-position, compared to the wild type enzyme. TnBgl1A_N221S/P342L was then immobilised to support materials to allow reuse and also to be used in a continuous flow system.

The combination of extraction and hydrolysis of quercetin glucosides from onion in a continuous flow system was not as trivial as originally expected. The total time was quite long, 2 hours, due to slow extraction at optimal hydrolysis conditions. However, by using an on-line method, manual work was reduced and no extra separation step of extract and immobilised enzyme was needed.

Molecularly imprinted polymers were developed to accomplish the step after extraction and hydrolysis, i.e. isolation of quercetin from the onion extract. The imprinted polymers were tested for isolation of quercetin from aqueous yellow onion extract, and it was found that the binding capacity of quercetin to MIP increased significantly with increasing temperature.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

I Sverige produceras dagligen flera ton biprodukter avfall inom jordbruks-, livsmedels- och skogsindustrierna. Detta avfall förbränns, komposteras och går till biogasproduktion samt i vissa fall till djurfoder. Intressanta avfallsgrupper ur ett svenskt perspektiv är lök- morots-, och potatis avfall från jordbruk- och livsmedelsindustrin och bark från skogsindustrin. Dessa avfallsgrupper är intressanta eftersom ur dessa kan värdefulla ämnen extraheras, som t.ex. antioxidanter och olika färgpigment. Dessa värdefulla ämnen kan eventuellt användas som tillsats i olika produkter och ersätta de syntetiska ämnen som oftast används idag i t.ex. livsmedel, kosmetika och läkemedel. I denna avhandling har lök studerats. Gul lök men även vissa andra löksorter, som t.ex. rödlök och schalottenlök, innehåller ett ämne, quercetin. Detta är en antioxidant som skyddar lök och andra växter från påverkan av bl.a. UV-strålning och mögel- och svampangrepp.

För att extrahera quercetin från gul lök och andra växter används vanligtvis lösningsmedel som t.ex. etanol och metanol. Dessa lösningsmedel framställas ofta från fossila råvaror, vilket medför att produktion och destruktion av dem kan belasta miljön. Anledningen att dessa lösningsmedel vanligtvis används för att utvinna quercetin är att quercetin har hög löslighet i dessa lösningsmedel. I detta forskningsprojekt har istället varmt vatten använts som lösningsmedel, då detta varken har negativ effekt på miljön eller på de som arbetar med det, jämfört med de flesta organiska lösningsmedel. Vatten är ett polärt ämne, vilket medför att lösligheten av quercetin är låg eftersom quercetin inte är lika polärt. Genom att öka temperaturen på vatten, minskar dess polaritet vilket medför ökad löslighet av quercetin, vilket i sin tur ökar utbytet av quercetin. Om behållaren trycksätts så höjs vattnets kokpunkt och temperaturer över 100 grader går att använda vid extraktion. Quercetin återfinns oftast i lök och andra växter med inbundna sockergrupper. Dessa gör att quercetins löslighet i vatten ökar, vilket är bra ur ett extraktionsperspektiv. För att förenkla kvantifieringen av quercetin i extraktet har ett enzym använts som tar bort sockergrupperna från quercetin efter extraktionen. Detta medför att det bara finns en sort av quercetin att kvantifiera och inte både quercetin och olika quercetin-glukosider.

Andra skäl att ta bort sockergrupperna är att quercetins antioxidativa effekt är bättre utan inbundna sockergrupper samt att de standarder som behövs för att bestämma mängden av de olika varianterna av quercetin är mycket dyra. Att använda sig av enzym för att katalysera en reaktion, t.ex. hydrolys av quercetin-glukosid till quercetin och glukos, kallas biokatalys. Samma reaktion kan även katalyseras av starka syror, t.ex. saltsyra. Dock medför produktion av saltsyra en större belastning på miljön med avseende på energianvändning, jämfört med enzymproduktion. Det enzym som jag har använt är β-glukosidas och detta enzym finns hos en mängd olika organismer. Även vi människor har detta enzym i våra tarmar där det katalyserar olika reaktioner, bl.a. hydrolys av quercetin-glukosider till quercetin. I denna studie har enzym från Thermotoga neapolitana använts, vilket är en bakterie som återfinns i varma källor i Neapel. Då enzymet kommer från en organism som lever vid höga temperaturer, har även enzymet sin optimala aktivitet vid höga temperaturer. Detta är en stor fördel eftersom själva extraktionen av quercetin-glukosiderna görs vid höga temperaturer och ingen nedkylning behövs före hydrolys. Efter extraktion och hydrolys är nästa steg att extrahera/isolera quercetin från löksoppan, som innehåller många andra ämnen. Detta kan göras på olika sätt, t.ex. genom att använda ett material som quercetin kan binda in till. I ett av projekten har sk ”molecular imprinted polymers” (MIP) testats. MIP är en polymer där man gjort avtryck av det ämne man är intresserad av, i detta fall quercetin. MIP kan liknas med ett lås och en nyckel. Det finns många nycklar som bara har små skillnader mellan sig men trots det finns det bara en nyckel som passar i låset. Det svåra med att använda MIP i ett vattenextrakt är att selektiviteten för quercetin minskar.

Forskningen beskriven ovan har studerats och resultat av försöken finns presenterade i paper I-V.

Sammanfattningsvis finns det några resultat som kan lyftas ut. Det visade sig att använda vatten och enzym istället för metanol och saltsyra har mindre påverkan på miljön när det gäller utsläpp av växthusgaser och energianvändning (paper I). Reaktionshastigheten för hydrolys av quercetin-glukosider berodde på var på quercetin molekylen glukos var inbundet (paper I). Dock ökade reaktionshastigheten när aminosyrasammansättningen modifierades i den del av enzymet där quercetin-glukosiderna binder in och glukos tas bort (paper I och II) och det var en modifiering som visade sig bättre än övriga testade modifieringar (paper II). Modifierat och icke modifierat enzym bands in till olika bärarmaterial (paper III), eftersom det då blir lättare att separera enzymet från lökextraktet och att återanvända enzymet. Eftersom höga temperaturer används i extraktions- och hydrolysstegen testades temperaturstabiliteten av bärarmaterialen (paper III). Resultatet visade att de inte påverkades av de höga temperaturer som behövs. Då enzymet är inbundet till ett bärarmaterial kan det användas i ett flödessystem där extraktion och hydrolys görs direkt efter varandra och inte i två separata steg (paper IV). Dock visade det sig att det ej var lätt att göra extraktion och hydrolys i en följd då de optimala betingelserna för extraktion och hydrolys inte var lätta att kombinera (paper IV). Olika MIP producerades och när dessa studerades i lösningar som innehöll quercetin visade det sig att mer quercetin band in till MIP om en högre temperatur användes (paper V).

Det finns mycket kvar att studera när det gäller att utveckla tekniker och metoder för att utvinna antioxidanter och andra intressanta ämnen från industriella biprodukter och avfall, men i denna avhandling visar att det finns goda chanser att utveckla metoder som ger mindre effekt på miljön än de som används idag.

• author: Lindahl, Sofia
• supervisor: Charlotta Turner; Eva Nordberg Karlsson
• opponent: Professor Emmer, Åsa, Analytical Chemistry, Department of Chemistry, School of Chemical Science and Engineering, Royal Institute of Technology, KTH
• organization: Centre for Analysis and Synthesis
• publishing date: 2012
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Organic Chemistry
• keywords: extraction, flavonoids, quercetin, biocatalysis, beta-glucosidase, sustainable chemistry, hyphenation, molecularly imprinted polymers, onion
• defense location: Lecture hall K:B, Kemicentrum, Getingevägen 60, Lund
• defense date: 2012-01-27 09:30:00
• ISBN: 978-91-7422-286-9
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Organic chemistry (S/LTH) (011001240)
• id: 7bcfbf0e-79e6-4d77-81f8-c12805d00535 (old id 2275427)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:35:51
• date last changed: 2023-04-18 18:26:26