Partitioning of biomolecules in thermoseparating polymer-water two-phase systems

Abstract

The partitioning behaviour of different types of molecules in thermoseparating two-phase systems has been studied. A thermoseparating two phase system was formed by heating a water solution, which contained a thermoseparating polymer, above the cloud point temperature. The thermoseparating polymers studied were: random copolymers of ethylene oxide and propylene oxide (EOPO-polymers), and ethyl(hydroxy ethyl)cellulose. The phase behaviour of ternary systems composed of a thermoseparating polymer, water and a cosolute was investigated. Strongly hydrophobic and hydrophilic cosolutes caused a decrease of cloud point temperature of the system compared with corresponding cosolute-free system. Separation of amino acids and peptides in the thermoseparating polymer/water two phase system was obtained. The more hydrophobic, aromatic amino acids or peptides were partitioned to the polymer rich phase, while most other amino acids, lysinyl- and glycinyl peptides partitioned to the water rich phase. The influence of salts on the partitioning of charged amino acids and peptides was strong. The positively charged polypeptide poly(Lys,Trp) was quantitatively partitioned to the polymer rich- or the water rich phase upon the addition of NaClO4 and Na2SO4, respectively. The partitioning of albumin and lysozyme in an aqueous two phase system was investigated. The top and bottom phases in this two phase system contained a thermoseparating EOPO-polymer and dextran, respectively. Albumin and lysozyme were partitioned to the top phase by the addition of the salts triethylammonium phosphate and NaClO4, respectively. By heating the top phase separately, a new two phase system was obtained composed of a water rich top phase and a polymer rich bottom phase. In this system the proteins were quantitatively partitioned to the water rich phase. Model calculations based on the Flory-Huggins theory of polymer solutions reproduced qualitatively the experimental results

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Ämnen som har stor löslighet i vatten kallas i regel för "hydrofila", vilket betyder "vattenälskare". Exempel på sådana ämnen är socker, koksalt, ättika och etanol. Dessa ämnen består av små molekyler. Det finns emellertid även ämnen som består av stora molekyler och som också har stor löslighet i vatten, t. ex. gelatin, stärkelse och agar. En annan grupp av ämnen har låg löslighet i vatten. Exempel på sådana ämnen är kolväten. Dessa ingår som blandningar i tex olja och bensin. Dessa ämnen kallas för hydrofoba (=vattenhatare). För att förklara olika ämnens löslighet i ett lösningsmedel kan man införa begreppet "kemisk drivkraft". Denna kemiska drivkraft kan i sin tur uppdelas i två olika drivkrafter, nämligen "h" och "s". "h" som kallas "entalpi" kan ses som en attraktions eller repulsions kraft mellan molekylerna. Om ett ämne löser sig i vatten betyder det i regel att ämnet har en attraktion till vattnet eller blott en liten repulsion. "s", kallas för entropi och bestäms av hur många olika sätt en molekyl kan befinna sig (eller uppträda) i lösningen eller det rena ämnet. T.ex en sockermolekyl i en sockerkristall kan inte befinna sig på så många olika sätt som en sockermolekyl upplöst i vatten, helt enkelt därför i vattnet kan sockermolekylen simma omkring i en mycket större volym än vad sockerkristallen kan erbjuda. Entropin gynnar alltså upplösning av sockret. Detta fenomen är generellt och följaktligen finns det alltid en grunddrivkraft för ämnen att bli upplösta i ett lösningsmedel. Anledningen till att vissa ämnen ändå inte blir upplösta beror i regel på att vattnents molekyler har en större attraktionskraft mellan sig själva än mellan vattnet och det främmande ämnet. Man kan säga att det råder en repulsion mellan vattnet och det främmande ämnet. Ämnen som löser sig har en attraktion till lösningsmedlet. Vad bestämmer om en molekyl har en attraktion till lösningsmedlet? Detta avgörs av skillnaden i "kemisk karaktär" mellan ämnet och lösningsmedlet. En molekyls "kemiska karaktär" bestäms sin tur av elektronernas fördelning i molekylen. Om denna fördelning är ojämn kallas ämnet polärt; är fördelningen jämn kallas den opolär. Om en molekyl är väldigt stor och består av likadanna grundenheter, tex molekylen X-X-X-X...osv. kallas den för polymer. Polymeren består av grundenheterna X som är bundna till varandra i serie. X kan i princip vara vilken molekyl som helst, bara den kan binda sig själv i en lång kedja. Exempel på polymerer är plaster som i regel är uppbygda av kolväten. Stärkelse är också en polymer och är uppbyggd av sockerenheter. Polyetenoxide är en polymer uppbyggd an etylen oxide enheter. Den har en stor löslighet i vatten i ett stort temperatur intervall. Grundenheten etenoxid är relativt polärt. Genom att koppla flera polära grundenheter till varandra borde också polymeren som helhet bli polär, och det blir den också, men inte alltid! Detta beror på att polariteten hos grundenheten X har en riktning. Tex. om X har fler elektroner på ovansidan av molekylen så har polariteten en riktning uppåt. Om X snurrar ett halvt varv är polaritetens riktning nedåt. Om nu ett X har polaritetens riktning uppåt och dess närmaste granne har riktningen nedåt så tar dessa polariteter ut varandra och X och dess granne blir som helhet mindre polärt eller helt opolärt. Om denna process sker på många olika ställen i polymeren så kan hela polymeren bli opolär trots att grundenheterna alltså var polära. Om polymeren blir tillräckligt opolär kommer den inte längre att vara löslig i vattnet utan snarare i opolära lösningsmedel. Man kan göra Polyetylenoxide mer opolär genom att värma en vattenlösning av den till ca 120°C. Då börjar polymeren att falla ur lösningen. Detta kallas för termoseparering och är ett ovanligt fenomen eftersom de flesta ämnen får en ökad löslighet vid högre temperaturer, vilket nästan alltid beror på att entropin "s" får större betydelse än entalpin "h" vid högre temperaturer. Hur kommer det sig då att polymeren blir mer opolär vid högre temperaturer? Jo, eftersom polaritetens riktning kan variera hos grundenheterna X, så finns det en entropi associerad med de olika kombinationerna man kan få med X med olika riktningar. Att ha alla X i en och samma riktning är osannolikt och alltså entropiskt ogynnsamt. Att ha många X så att polymerenen är opolär är entropiskt gynnsamt men entalpiskt ogynnsamt eftersom opolära ämnen repelleras av vatten. Vid ett visst temperatur intervall kommer polymeren att bli mer opolär och därmed bli vattenolösligt. Då polymeren faller ut ur vattenlösningen bildas alltså två faser. Där den ena fasen utgörs av nästan rent vatten och den andra fasen innehåller all polymer och en del vatten. Temperaturen då polymeren börjar falla ur lösningen kallas för "cloud point" temperaturen eller CPT. Detta namnet har den fått eftersom lösningen blir grumlig, "vitmjölkig" och "moln"-liknande vid CPT. Polymerer uppbyggda av entenoxid enheter uppvisar ofta fenomenet termoseparering i vatten. Ucon är en sådan polymer (den finns i bilarnas bromsvätskor) uppbyggd av etenoxid och propenoxid. Den har en CPT vid 50°C i vatten. Genom att tillsätta olika ämnen kan CPT ändras uppåt eller nedåt. Hydrofila och hydrofoba tillsatser sänker CPT medans amfifila ämnen höjer eller lämnar CPT oförändrad. De två faserna man erhåller genom att värma polymer lösningen kan användas för att separera biomolekyler som aminosyror, peptider eller proteiner i en blandning. Detta går till enligt följande: Biomolekylerna och polymeren löses ihopp med vatten vid låg temperatur (tex. 22°C), därefter värms lösningen till tex 60°C, då bildas de två faserna. Man finner då att biomolekylerna fördelar sig olika i dessa två faser. Proteinerna och hydrofila aminisyror och peptider återfinns i vatten fasen, medans hydrofoba aminosyror och peptider fördelar sig till polymerfasen. Genom att tillsätta olika salter eller ändra pH kan man öka eller minska fördelningen av biomolekylerna till polymerfasen. Detta tvåfas system kan alltså användas för upprening av hydrofoba biomolekyler ur en blandning.

• author: Johansson, Hans-Olof
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Haynes, Charles A.
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 1996
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: aqueous two-phase system, temperature-induced phase separation, amino acid and peptide separation, polymer, partitioning, Biology, Biologi
• pages: 46 pages
• defense location: N/A
• defense date: 1996-06-06 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUNKDL/(NKBK-1050)/1-141/1996
• language: English
• LU publication?: yes
• id: ec1fbfa3-07b1-4ae3-a3f8-e35f8d2c801a (old id 28534)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:13:32
• date last changed: 2018-11-21 21:09:44