Regulation of force and shortening velocity in smooth muscle

Abstract

Smooth muscle is characterised by high tension economy, low shortening velocity and regulation mainly by myosin light chain (MLC) phosphorylation. The aim of this study was to investigate regulation of force and maximal shortening velocity (Vmax) in smooth muscle. In intact muscle, activated with depolarisation, inhibition of force and rise in intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) by 2,3-butanedione monoxime (BDM) suggested influx of Ca2+ across the cell membrane as the major source of activator Ca2+ during contraction. Decreasing temperature (37-2 C) reduced peak and plateau (5 minutes after activation) force and [Ca2+]i (measured with fura 2 - technique). At 27 C, plateau force was inhibited by 50% at unchanged MLC-phosphorylation, compared to at 37 C. This suggests inhibition of a force-maintaining temperature sensitive process independent of MLC-phosphorylation. In demembranised ("skinned") preparations, inorganic phosphate (Pi), vanadate (Vi), BDM, temperature and the protein calponin were used to probe specific cross-bridge reactions. Presence of Pi increased rate of contraction (measured with photolytic release of ATP from caged ATP), but inhibited force. This shows that force-generation in smooth muscle is associated with the Pi-release reaction. Force was less sensitive to Pi, BDM and temperature variations than in striated muscle, suggesting differences in distribution of cross-bridge states. BDM reduced force, Vmax and MLC-phosphorylation. Vi reduced force and Vmax similarly to a reduction of [Ca2+]. Calponin reduced Vmax at largely unchanged force, whereas Pi at submaximal activation increased Vmax at reduced force. These results show that Vmax and force in smooth muscle can be regulated independently and that cross-bridge states acting as an internal load may be involved in regulation of Vmax.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Sammanfattning på svenska Muskelvävnad är specialiserad på att förkorta sig och utveckla kraft. Glatt muskulatur finns i blodkärlens väggar, i urinvägarna, i luftvägarna samt i mag-tarmkanalen, och är viktig för dessa organs funktion. Namnet "glatt" (smooth) härrör från muskulaturens utseende i mikroskop. Den glatta muskulaturen ser slät ut, i motsats till det "randiga" mönstret från den tvärstrimmiga muskulaturen i skelettmuskler och hjärta. Inuti muskelcellerna bildar proteinerna aktin och myosin tunna respektive tjocka filament, som i tvärstrimmig muskel sitter mycket regelbundet ordnade i små (ca 2 um långa) enheter kallade sarkomerer. I glatt muskulatur finns inga sarkomerer (se Figure 1), men förkortning anses ändå ske genom att filamenten glider i förhållande till varandra på ett liknande sätt som i tvärstrimmig muskulatur. I en avslappad (relaxerad) muskel har aktin och myosin svag kontakt med varandra. När en signal till aktivitet når den glatta muskeln (via t ex nerver, hormoner eller sträckning av muskulaturen), ökar den intracellulära koncentrationen av calcium joner ([Ca2+]i), dels genom att Ca2+ flödar in i cellen genom kanaler i cellmembranet, dels genom frisättning av Ca2+ från intracellulära lagringsstrukturer (sarkoplasmatiskt retikel; SR). Olika typer av glatt muskulatur och olika faser under kontraktionen ("topp"-kraften i början av kontraktionen, respektive kraften under "platå"-fasen vid en ihållande kontraktion) tycks vara olika mycket beroende av Ca2+-inflöde från det extracellulära rummet, respektive av Ca2+-frisättning från SR. Ökad [Ca2+]i leder till att Ca2+ tillsammans med proteinet calmodulin och ett enzym (myosin light chain kinase; MLCK) katalyserar en fosforylering på myosinmolekylen. Då myosinet defosforyleras av ett annat, ständigt aktivt, enzym (myosin light chain phosphatase; MLCP), slappas muskeln av. Eftersom sammandragningen av glatt muskulatur styrs av fosforyleringen på myosinet, säges glatt muskulatur vara reglerad av de tjocka filamenten. Allmänt kan man säga att ju mer myosin som är fosforylerat, desto mer kraft utvecklas. Aktiverade myosinfilament kan binda sig hårt till aktin med utskott benämnda tvärbryggor eller huvuden. Genom en liten knickning av tvärbryggan uppstår en rörelse; kraft. Själva knickningen av huvudet föregås av att myosin binder och spjälkar (hydrolyserar) adenosintrifosfat (ATP), varpå hydrolysprodukterna fosfat (Pi) och adenosindifosfat (ADP) lossnar. Detta sker i en cyklisk kedja av kemiska reaktioner; tvärbryggecykeln. Den energi som frigöres då ATP spjälkas omsättes av muskeln i mekaniskt arbete, men hur de kemiska reaktionerna som frigör energi är kopplade till det mekaniska arbetet är ofullständigt känt. Teorier om tvärbrygge-cykelns förlopp i glatt muskulatur baseras på kunskaper om tvärbryggecykeln i skelettmuskulatur, men glatt muskulatur har egenskaper som gör den intressant att studera och jämföra med tvärstrimmig muskulatur. Kontraktionen i glatt muskulatur är ekonomisk. Glatt muskulatur kan utveckla lika hög kraft som skelettmuskulatur per tvärsnittsyta, men energiåtgången under kontraktion är lägre. Förkortningshastigheten är också lägre och kontraktionen börjar och avslutas långsamt. Efter att kontraktionen i glatt muskulatur väl börjat, kan kraft bibehållas trots att myosinfosforyleringen och energiåtgången sjunker, vilket har förklarats med att det bildas en grupp av tvärbryggor, benämnda "latch"-bryggor, som är starkt bundna till aktinet, och alltså genererar kraft, fast dom inte är fosforylerade. Målsättningen med de här presenterade delarbetena har varit att undersöka några aspekter av hur kraft och förkortningshastighet regleras i glatt muskulatur. En del av förklaringen till den glatta muskulaturens egenskaper kan finnas i hur tvärbryggecykelns reaktioner regleras, och en del i hur den intakta cellens aktiveringssystem regleras. Försöken genomfördes på en glatt muskel, från marsvin, löpande i tre band längs tjocktarmen (taenia coli- muskeln). Denna muskel anses fungera likadant som andra typer av glatt muskulatur. Försöken utfördes dels på preparat med cellmembranen bevarade (intakta preparat), dels på preparat där cellmembranen avlägsnats (skinnade preparat). Intakta preparat användes i delarbete II och VI. Under de flesta försöken aktiverades muskeln genom en lösning med hög kaliumjonkoncentration, vilket depolariserar cellmembranet och leder till en ökning av [Ca2+]i. I delarbete II studerades hur ämnet 2,3-butanedione monoxime (BDM), ursprungligen använt som motgift vid nervgasförgiftningar, men senare som hämmare av muskelkontraktion, påverkar kraft och [Ca2+]i. BDM visade sig hämma kraft och ökning av [Ca2+]i på motsvarande sätt som när man sänker extracellulär [Ca2+], vilket visar att BDM sannolikt hämmar inflödet av Ca2+ över cellmembranet, och att kraften under platåfasen i intakta muskelpreparat aktiverade med depolarisation är beroende av inflöde av Ca2+ över cellmembranet. I delarbete VI studerades hur olika temperaturer påverkade kraft, [Ca2+]i och fosforylering. Både topp- och platåkraft var hämmade vid temperaturer under 37 oC, ner till 2 oC. Hämningen var olika beroende på om man nådde en viss temperatur från högre eller lägre temperatur (hysteres). Det mest påfallande fyndet var emellertid att platåkraften vid 27 oC var halverad jämfört med platåkraften vid 37 oC, medan toppkraften bara var hämmad med 15%. En förklaring till den minskade kraften skulle kunna vara att [Ca2+]i var lägre vid 27, 17 och 7 oC än vid 37 oC. Emellertid visade sig myosinfosforyleringen vara oförändrad vid 27 jämfört med vid 37 oC. Detta fynd kan förklaras av att [Ca2+]i minskade med en faktor 2, och med kännedom om att temperaturkänsligheten (uttryckt som Q10-värden) för MLCK och MLCP gör att dessas aktiviteter minskar med en faktor 2 respektive 5, då temperaturen minskas 10 oC. Balansen mellan de parametrar som tenderar att öka fosforyleringen (Ca2+ och MLCK), och den som tenderar att minska fosforyleringen (MLCP) är då ungefär densamma vid de två temperaturerna. Genom att analysera resultaten enligt en modell för hur "latch"-bryggor bildas, kan man visa att de minskade absoluta hastigheterna för fosforylering och defosforylering skulle ge minskad andel "latch"-bryggor, och allstå mindre kraft, men bara motsvarande en reduktion med ca 10%. Återstoden av krafthämningen under platåfasen vid 27 oC måste därför förklaras med en annan mekanism, förutom en hämning av "latch". I delarbete I-V användes demembraniserade ("skinnade preparat") i vilka cellmembranen avlägsnats genom behandling med ett ytaktivt ämne (Triton). I dessa preparat kan man studera tvärbryggecykelns reaktioner, och hur dessa påverkas av intracellulära aktiveringsmekanismer (myosinfosforylering). Koncentrationer av joner (Ca2+), salter, energisubstrat (ATP) mm, i den "intracellulära" lösningen vari man badar muskelpreparatet kan kontrolleras och proteiner kan tillföras. I skinnade preparat mättes, i närvaro av oorganiskt fosfat (Pi; delarbete I); de så kallade fosfatanalogerna BDM (delarbete II) och vanadat (Vi; delarbete III); proteinet calponin (delarbete IV) samt vid olika temperaturer (delarbete V), kraft, hastigheten med vilket kraft byggs upp, samt den högsta hastighet med vilken filamenten kan glida förbi varandra under förkortning (maximal förkortningshastighet; Vmax). Dessa mekaniska parametrar påverkas av tvärbryggereaktioner. Höga koncentrationer av Pi (20 mM) ledde till att kraft byggdes upp med en högre hastighet, men till en lägre nivå än i kontrollsituationen utan Pi. Detta visar att mekanisk kraft uppstår i samband med den tvärbryggereaktion där Pi lossnar. Krafthämningen av Pi och BDM var mindre än i skelettmuskulatur, vilket antyder att glatt muskulatur har färre kraftgenererande tvärbryggor som kan binda Pi och BDM. Krafthämningen av BDM kunde i de skinnade preparaten till stor del förklaras av en hämning av myosinfosforylering. Hastigheten med vilken kraft byggs upp minskade med minskande temperatur, troligen beroende på att ATP-hydrolyssteget i tvärbryggecykeln blev långsammare, och ökade med ökande temperatur, Då själva kraftgenererande stegets hastighet ökade. Vmax ökade med ökande temperatur, vilket avspeglade att hastigheten på ADP-frisättningsteget ökar med ökande temperatur, och filamenten lossnar från varandra snabbare. I kontrollmuskler finns ett förhållande mellan kraft (motsvarande [Ca2+] eller fosforyleringsnivå) och Vmax. Ju högre kraft, desto högre Vmax. I närvaro av Pi, var Vmax opåverkad eller ökade, trots att kraften minskade. I närvaro av calponin blev Vmax lägre. Med Vi minskade kraft och Vmax på liknande sätt som med submaximala [Ca2+], dvs kraft och Vmax minskade ungefär proportionerligt. BDM minskade Vmax sannolikt p g a att fosforyleringen hämmades. Kraft och Vmax regleras alltså av olika tvärbryggesteg och kan regleras oberoende av varandra. Vissa tvärbryggetillstånd kan verka som en inre belastning (internal load) och hindra filamentens glidning i förhållande till varandra. Pi tar bort sådana belastande tvärbryggor, medan calponin och Vi leder till att de bildas. Frågeställningarna i den här studien är främst av teoretiskt intresse, och avser att belysa hur den biologiska motorn i en ekonomisk, stark och långsam muskel fungerar. I tvärstrimmig muskulatur har ackumulering av Pi vid uttröttande muskelarbete (fatigue) angivits som en orsak till minskad förmåga att utveckla kraft. Eftersom glatt muskulatur i sin karakteristik är uthållig, kan det vara av intresse att jämföra en "fatigue-liknande" situation med den i skelettmuskel, och se vad som karaktäriserar denna i glatt muskulatur. Av vidare intresse kan vara att använda denna teoretiska kunskap som bidrag till förståelse av hur egenskaperna hos glatt muskulatur kan påverkas och förändras vid t ex tillväxt eller åldrande av organ innehållande glatt muskulatur, och vid /mer tillfälliga/ förändringar såsom syrebrist (hypoxi) eller hindrad tillförsel av blod till vävnaden (ischaemi).

• author: Jaworowski, Åsa
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Docent Nilsson, Holger, Farmakologisk Institut Aarhus Universitet, Aarhus, Danmark
• publishing date: 1996
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Developmental Biology
• keywords: calponin, temperature, internal load, shortening velocity, cross-bridges, calcium, Smooth muscle, MLC-phosphorylation, Pi, Vi BDM, Physiology, Fysiologi
• pages: 177 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg Neuroscience Center
• defense date: 1996-10-17 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MEFN--05--SE
• language: English
• LU publication?: no
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Molecular and Cellular Physiology (ceased) (LUR000011)
• id: 9e4112e8-805a-4672-9ed9-b8205ee2be50 (old id 28729)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:10:15
• date last changed: 2018-11-21 21:09:24