From Sequence to Structure- Characterizing Human and Plant Aquaporins

Abstract

Aquaporins constitute a class of membrane proteins that create pores through the lipid bilayer of biological membranes, facilitating the passage of water and other small solutes. Nearly all living organisms possess a more or less intricate set up of aquaporin proteins and the importance of these channels has been implicated in many aspects of health and disease. The aim of the projects summarized in this thesis was to increase the knowledge about the structure and function of aquaporins. A method for obtaining high levels of recombinantly expressed membrane proteins in the yeast Pichia pastoris by screening for clones with multiple recombinant gene inserts was developed. Subsequent to overexpression, a number of different purification schemes for obtaining preparations for molecular characterization were established and three aquaporin isoforms; human HsAQP5 and HsAQP8 and a plant aquaporin, NbXIP1;1, were successfully purified. The two human isoforms were reconstituted into artificial liposomes and by functionality assessments their water transporting capacity was confirmed. The verification of retained functionality after recombinant expression and subsequent purification trials is crucial in order to validate the quality of the protein that goes into crystallization and structure determination trials. By using two different crystallization techniques, diffracting crystals of both HsAQP5 and HsAQP8 were obtained and subsequently, a high resolution structure of HsAQP5 was solved.

A different approach was used to identify hypothetical aquaporins in the chloroplast, which is the organelle responsible for the conversion of sunlight into chemical energy in plants. By immunoblotting procedures and mass spectrometry analyses, the presence of several aquaporin isoforms was confirmed, suggesting a possible dependence of the photosynthetic reactions on an assisted trans-membrane water flux.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Biokemi, livets kemi, är den gren av naturvetenskapen som avhandlar de molekyler och kemiska processer som är nödvändiga för allt levandes existens. Genom att karakterisera livets molekyler och deras funktion vill man öka förståelsen kring vad som krävs för att en organism ska kunna leva, växa, fortplanta sig och anpassa sej till nya miljöer och förhållanden. Som biokemist har man ofta till uppgift att visualisera det som inte med blotta ögat kan uppfattas, en tuff men spännande utmaning.

De biomolekyler vi valt att studera tillhör en klass av proteiner som kallas aquaporiner, och utgör kanaler genom de lipidrika höljen, eller membran, som omger en cell och som dessutom definierar intracellulära strukturer. Aquaporiner underlättar flödet av vatten (därav namnet) eller andra små och oladdade molekyler över cellens membran. Individer från denna proteinfamilj har återfunnits i alla livsformer, såväl hos djur och växter som hos bakterier och svampar. Vissa aquaporiner återfinns i stora kvantiteter i naturen, medan merparten produceras i relativt blygsam skala. Detta innebär ett problem då man vill studera dessa vattentransportörers biokemiska egenskaper. Vi har därför utvecklat ett protokoll för att, på genetisk väg, kunna modifiera jästsvampen Pichia pastoris, en släkting till den bagarjäst man kan köpa i livsmedelsbutiken, så att den kan producera aquaporiner och andra membranlokaliserade proteiner i stora mängder. Fortsättningsvis har vi utarbetat optimerade metoder för att utvinna rena preparationer av dessa, artificiellt producerade proteiner genom att extrahera dem från jästcellerna och vidare separera dem från de proteiner som naturligt finns i P. pastoris. Då en stor mängd av det protein man önskar studera erhållits, möjliggörs biokemisk karakterisering av detta.

Två vattentransporterande kanaler, aquaporin 5 (AQP5) och aquaporin 8 (AQP8) från människa, har vi studerat närmare. Aquaporinerna, som producerats i P. pastoris och därefter extraherats och renats, sattes in i liposomer. Liposomer är artificiella lipidmembraner i sfärisk konformation, som grovt sett kan liknas vid såpbubblor i mikroformat. Insatt i ett sådant konstgjort membran kan vattenkanalerna studeras utan att andra proteiner och kemiska processer påverkar analyserna. Genom att undersöka AQP5 och AQP8 insatta i liposomer kunde vi se att det protein vi producerat var funktionellt och hade en förmåga att transportera vatten. Då vi fastställt funktionaliteten, övergick vi till att försöka bestämma den tredimensionella strukturen hos dessa båda aquaporiner.

Eftersom en aquaporin är mycket liten med en ungefärlig diameter på 6 nm (sedd från cellens utsida) krävs raffinerade metoder för att visualisera dess uppbyggnad i detalj. Först måste proteinerna packas i ordnade kristaller, likt kolatomerna i en diamant eller vattenmolekylerna i en isbit. Genom att skjuta partiklar genom kristallerna och detektera hur dessa sprids då de studsar mot proteinets atomer som sitter i ett ordnat gitter, erhåller man ett så kallat diffraktionsmönster. Med hjälp av en rad avancerade matematiska beräkningar kan man sedan omvandla diffraktionsmönstret till en mängd datapunkter som beskriver atomernas position i proteinstrukturen. Vi har lyckats skapa ordnade kristaller av AQP5 och AQP8. Kristallerna av AQP5 visade sig dessutom vara av så god kvalitet att de resulterade i ett diffraktionsmönster som kunde översättas till en högupplöst proteinstruktur, det vill säga en avbildning av proteinet där aminosyrornas sidokedjor och de vattenmolekyler som befinner sig i kanalen, kan urskiljas. Förutom att man, med hjälp av denna molekylära avbildning, bättre kan förstå funktionen hos AQP5, kan proteinstrukturer som denna dessutom användas till exempel vid datasimuleringar av proteinets interaktioner med mindre molekyler. Sådana simuleringar ger viktiga upplysningar om man till exempel vill designa en molekyl som blockerar den aquaporin-assisterade vattentransporten.

I ett annat delprojekt undersökte vi växternas solenergiomvandlingsfabrik; kloroplasten, den del av växtcellen där klorofyllet, som ger växter deras gröna färg, återfinns. Eftersom vatten konsumeras vid fotosyntesen, då koldioxid omvandlas till energirika sockermolekyler och syre, spekulerade vi att en aquaporin assisterad vattentransport över kloroplastens membran kunde vara motiverad. Genom att tillämpa biokemiska metoder kunde vi fastställa förekomsten av vattenkanaler i kloroplastens olika membran. Om förekomsten av dessa är kritisk för effektiviteten hos fotosyntesen återstår att utröna, men om så är fallet kan dessa aquaporiner utgöra ett potentiellt mål för genetisk modifiering med syfte att skapa mer snabbväxande grödor.

• author: Nordén, Kristina
• supervisor: Urban Johanson
• opponent: Associate Professor de Gier, Jan Willem, Stockholm University, Dept. of Biochemistry and Biophysics, Stockholm, Sweden
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2012
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• pages: 154 pages
• defense location: Hörsal B, Kemicentrum, Lund
• defense date: 2012-09-21 09:30:00
• ISBN: 978-91-7422-304-0
• language: English
• LU publication?: yes
• id: aa39038b-9419-42f4-8111-3adf9a2a7378 (old id 3015253)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:07:33
• date last changed: 2018-11-21 21:02:49