A Proteomic Dissection of Breast Cancer - Via Cells and Organelles to Pathways

Abstract

Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer and the leading cause of cancer death in females worldwide. Breast tumours are extremely heterogeneous, and each patient’s disease has different causes, prognosis and appropriate treatments associated with it. To enable a more individualised therapy, there is a substantial need for better characterisation of tumours and a deeper understanding of the molecular mechanisms of disease initiation, progression and treatment resistance.



During the last decade, shotgun proteomics has evolved as a powerful tool, complementing the fields of genomics and transcriptomics, for the elucidation of pathway and network changes in cancer. The proteome is, however, with its large dynamic range and numerous post-translational modifications, tremendously more complex than the genome and an additional level of complexity is provided by the spatial arrangements of proteins in different organelles.



In this thesis we have addressed technical challenges such as optimising proteomic coverage by evaluating different protein and peptide separation methods and mapping proteins to organelles with density gradient organelle fractionation followed by proteomic quantification of the fractions. Further, we applied both a discovery mode of proteomics and a focussed pathway centric method to evaluate the response of breast cancer cell lines to chemotherapeutic agents. Proteomic pathway analysis was also utilised to investigate and explain the differential response to therapy in different breast tumour subpopulations.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Bröstcancer är den mest frekventa cancerformen bland kvinnor, 1 av 8 drabbas någon gång under sin livstid av sjukdomen. Införandet av mammografi har gjort att cancern upptäcks tidigare och detta, tillsammans med effektivare behandlingsformer, har bidragit till att dödligheten i bröstcancer sjunkit de senaste decennierna. Antalet fall av bröstcancer ökar dock ständigt, framför allt på grund av en åldrande befolkning och ändrade levnadsvanor.



Bröstcancer behandlas med operation, i vissa fall tillsammans med strålning, för att avlägsna tumören. Dessutom behandlas patienter vanligen också med hormonterapi och/eller cellgifter eftersom en sådan behandling är systemisk, det vill säga når ut i hela kroppen, och minskar risken för spridning av bröstcancerceller till andra organ och på så sätt återkomsten av cancern i form av sekundära tumörer, s.k. metastaser. Det varierar hur olika patienter svarar på hormon- och cellterapi och många drabbas olyckligtvis ändå av metastaser. Detta beror på att cancertumörer hos olika patienter, även med ursprung från samma organ, kan skilja sig mycket åt när det gäller till exempel storlek, form, utbredning, invaderande egenskaper eller tillväxttakt. Dessutom finns det en heterogenitet mellan cancerceller i en och samma tumör, vilken har stor betydelse vid val av behandling då den medför olika resistens hos cancercellerna mot hormon- eller cellgiftsbehandling. Syftet med denna avhandling var att med hjälp av nya tekniker studera dessa skillnader mellan olika typer av cancerceller.



Cancer uppstår till följd av mutationer i vår arvsmassa (DNA), som ackumuleras då de leder till förbättrade egenskaper för cancercellen. Idag har man identifierat flera mutationer i specifika gener som förknippas med en ökad risk att utveckla cancer. De flesta cancertumörer kan dock inte spåras enbart till ett genetiskt ursprung och därför räcker det inte att bara studera cellens DNA. Ett naturligt steg är att även undersöka proteiner, de aktörer i cellerna som generna kodar för, och som utför cellens alla essentiella uppgifter såsom energiproduktion, transport av ämnen in och ut ur cellen samt tolkning av signaler från omgivningen. För att kartlägga så många som möjligt av alla proteiner i en cell kan flertalet olika tekniker användas, ett samlingsnamn för dessa är proteomik. I studierna som presenteras i denna avhandling har jag använt en masspektrometri för att detektera och kvantifiera protein i cancerceller. Denna teknik har utvecklats mycket under de senaste åren och belönades med Nobelpriset i kemi år 2002 för upptäckten av särskilda joniseringsmetoder för proteiner. I masspektrometri joniseras molekylerna och delas upp i mindre fragment, vartefter de separeras utifrån deras förhållande mellan massa och laddning.



Till skillnad från DNA är proteiner dynamiska molekyler som hela tiden varierar i mängd och form i en cell. Detta resulterar i en enorm komplexitet och därmed svårigheter att detektera alla proteiner och dess varianter på en och samma gång. Därför har en mängd olika metoder för att separera prover i mindre komplexa fraktioner utvecklats. I Paper I utvärderas flera av dessa, och resultaten visar att en separation av proteiner efter deras vikt på en gel, så kallad SDS-PAGE, var den metod som identifierade flest proteiner i cancerceller. SDS-PAGE har sedan använts i övriga studier i denna avhandling (Paper II-IV).



Utöver vilka proteiner och mängden av dem som förekommer i en cell spelar deras plats i cellen en central roll. En cell består av flera olika mini-organ, så kallade organeller, i vilka olika uppgifter utförs. Exempel på dessa är lagring av information i cellkärnan, energitillverkning i mitokondrien och bearbetning, sortering och paketering av proteiner i golgiapparaten. Kännedom om i vilken organell ett protein förekommer kan därför hjälpa till att utröna vilken uppgift det har. Dessutom sker en konstant transport av protein mellan olika organeller, i vissa fall specifik för cancerceller. I Paper II har vi använt två likartade tekniker som bygger på en separation av organeller genom centrifugering följt av masspektrometri-analys. Studien visar att båda tekniker framgångsrikt kan användas för att bestämma proteiners organelltillhörighet, men den ena tekniken resulterar i fler antal identifierade och lokaliserade protein.



I Paper III studerades effekten av cellgifter på olika typer av cellinjer, dvs cancerceller ursprungligen från bröstcancerpatienter men anpassade för laboratorieodling. Den ena cellinjen var mer resistent mot cellgifterna, och för att förklara orsaken till detta utvecklades en känslig metod att studera de proteiner som är involverade i att reparera skador på DNA. I den mer resistenta cellinjen detekterades högre nivåer av dessa proteiner, och denna teknik har därför potential att användas inom cancervården för att förutspå respons av olika typer av behandling.



I Paper IV har vi studerat olika subpopulationer i bröstcancertumörer genom att dela upp cellerna i fyra grupper utefter protein (så kallade markörer) på deras yta. Alla utom en cellpopulation ger upphov till nya tumörer vid inplantering i möss, men denna population är även den mest resistenta mot östrogenbehandling. Vid proteomik-analys av cellerna upptäckte vi skillnader som ger en indikation om anledningen till dessa populationers fenotypiska skillnader.



Sammanfattningsvis har jag i denna avhandling utvärderat och optimerat olika tekniker för att identifiera och kvantifiera protein med hjälp av masspektrometri samt applicerat dessa för att studera skillnader mellan olika typer av bröstcancerceller som kan förklara deras olika känslighet mot cancerbehandling.

• author: Antberg, Linn
• supervisor: Peter James
• opponent: Albar, Juan-Pablo, Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spain
• organization: Department of Immunotechnology; BioCARE: Biomarkers in Cancer Medicine improving Health Care, Education and Innovation
• publishing date: 2013
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Engineering and Technology
• keywords: Proteomics, Mass spectrometry, Breast cancer, DNA repair, Organelle fractionation, Tumour subpopulations
• pages: 130 pages
• defense location: Lundmarksalen, Lund Observatory, Sölvegatan 27, Lund University Faculty of Engineering
• defense date: 2013-04-05 09:00:00
• ISBN: 978-91-7473-481-2
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 100e9e33-99fd-4bf4-b37a-0b7ac57c0ae0 (old id 3562585)
• date added to LUP: 2016-04-04 13:52:11
• date last changed: 2023-04-18 18:06:57