Molecular regulation of rat histidine decarboxylase

Abstract

Histamine is involved in a variety of physiological processes like gastric acid secretion, inflammation and neurotransmission. The production of histamine is catalysed by the enzyme histidine decarboxylase (HDC), which is a strongly regulated enzyme. Mammalian HDC mRNA encodes a protein with a molecular mass of 74 kDa, which is greater than that reported for the subunit of purified mammalian HDC, which is 54 kDa. The aim of the present thesis was to analyse whether this discrepancy in size may reflect a posttranslational processing and activation of the enzyme. This was performed by examining the expression of rat HDC in vitro and in vivo. Full-length HDC was essentially inactive when produced in various expression systems, whereas C-terminally truncated HDC corresponding to 54 kDa gave rise to high HDC activity when expressed in the same systems. To generate specific antisera against HDC, the enzyme was expressed in large amounts in bacteria and then purified. The antisera produced were able to immunocytochemically detect HDC in gastric mucosa from a variety of species as well as in rat hypothalamus. A Western blot technique for analysis of HDC was generated which revealed the presence of three different forms of HDC, corresponding to about 74-, 63- and 53 kDa, in rat gastric mucosa and fetal liver. The expression of the multiple forms of HDC in the rat gastric mucosa was studied in experimental situations known to induce HDC activity. It was demonstrated that induction of HDC by hypergastrinemia was reflected in a large increase in the amount of the intermediate form, which also was the most abundant form. Furthermore, the 63 kDa form was shown to have a turnover rate corresponding to that of the enzyme activity, indicating that this form was an enzymatically important form. In summary, the results strongly support the theory that HDC is produced as an inactive proenzyme which is posttranslationally processed into a shorter active form of 54 kDa and/or 63 kDa.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Enzymet histidin dekarboxylas - en nyckelroll i bildningen av histamin



Histamin är en välkänd substans som är en av orsakerna till bland annat allergiska symptom. Alla som har hösnuva känner väl till hur histamin verkar, svullnande ögon och rinnande näsa. Histamin är inblandad i en mängd olika funktioner i kroppen såsom allergiska reaktioner och inflammationer av alla de slag. I hjärnan fungerar histamin som en signalsubstans bland annat i samband med inlärning, ätande, drickande och illamående. Histamin är också en kugge i hjulet vid produktion av magsyra.



Histamin bildas genom att ämnet histidin omvandlas till histamin med hjälp av ett enzym som kallas histidin dekarboxylas, som brukar förkortas HDC. Syftet med min avhandling har varit att ta fram antikroppar mot HDC och med dess hjälp och med olika metoder studera regleringen av enzymet i celler och vävnad.



Forskning runt histamin och HDC har en lång tradition inom institutionen för fysiologi och neurovetenskap i Lund. På 50- och 60-talen röntes många framgångar inom detta område av bland annat professor G. Kahlson och docent E. Rosengren. Våra undersökningar är en fortsättning av deras forskning och med en övergång från traditionellt laboratoriearbete i fysiologi med djurförsök till en mer molekylärbiologisk inriktning med moderna metoder, där man arbetar med cellodling och in vitro (i glas) försök.



Proteiners storlek mäter man och uttrycker i måttenheten Dalton (Da). Före 1990 trodde man att HDC hade en storlek på 54 kDa, eftersom detta var den storlek man fick när man genom rening fick fram enzymet HDC. År 1990 knäckte en amerikansk forskargrupp DNA-koden för HDC och till allas förvåning visade det sig att proteinet var 74 kDa stort. Forskare insåg genast att någonting sker från det steg då proteinet skapas till att det har renats. Beror detta på hur man renar HDCet eller handlar det om en betydelsefull reglering i cellen? Vi frågade oss om det var någon skillnad på förmågan att omvandla histidin till histamin hos de olika storlekarna av HDCet, det vill säga om aktiviteten skiljer sig. Är det så och går det då att hitta de olika storlekarna i vävnad från till exempel magslemhinna? Med hjälp av DNA teknik tillverkade jag stora mängder av olika storlekar HDC i celler, in vitro och i bakterier. Det visade sig i alla system att det korta HDCet (54 kDa) hade mycket högre aktivitet än det långa HDCet (74 kDa). Nästkommande frågor var, om dessa HDC-former finns i vävnad från mage och hur tillverkningen regleras? För att studera detta behövs antikroppar mot HDC.



En grupp i Japan har tidigare tagit fram antikroppar mot HDC, men väldigt lite har funnits tillgängligt. Det behövs stora mängder av ett protein för att kunna få fram antikroppar och det har varit svårt att rena stora mängder av HDC från vävnader. Jag har istället tillverkat stora mängder HDC genom att sätta in det DNA som ger koden för HDC i en bakterie. Bakterierna kan man sedan odla fram i stora mängder och därefter rena HDCet. Det renade HDCet sprutades in i kaniner eller marsvin som efter ett tag producerade antikroppar mot HDC. Vi utnyttjar samma typ av funktion som hos människan gör att vi får antikroppar mot olika sjukdomar som t.ex. förkylningar.



De antikroppar som vi tog fram i samarbete med företaget Euro-Diagnostica i Malmö, provade vi ut med hjälp av olika tekniker. Antikropparna var mycket användbara och vid jämförelse minst lika bra som de japanska. Den japanska antikroppen känner bara igen HDC från råtta och mus medan vår nya antikropp känner igen enzymet även från groda, kyckling, mus och hund. Detta innebär att man kan studera förekomst och reglering av HDC med hjälp av våra antikroppar i andra djur än råtta och mus, vilket är en avsevärd förbättring mot tidigare antikroppar.



I samarbete med institutionen för farmakologi intresserade vi oss för hur HDC-aktiviteten regleras i råttmage. Många faktorer påverkar magsyrautsöndring och en substans som man vet påverkar både magsyratillverkning och HDC-aktivitet är gastrin som normalt tillverkas i magen. Om man ger gastrin till en råtta ökar HDC-aktiviteten betydligt. När vi med hjälp av våra antikroppar hittade HDC i magvävnad som behandlats med gastrin, upptäckte vi till vår förvåning tre olika storlekar av HDC. Förutom 74 och 54 kDa fanns ett protein på 63 kDa som våra antikroppar kände igen som HDC. Vid jämförelse mellan obehandlade och gastrinbehandlade råttor, så ökade alla tre former av HDC hos de som behandlats med gastrin, men mest ökade 63 kDa HDCet. Samma mönster visade sig också när man behandlade råttor med substansen omeprazole, som är den verksamma substansen i magsårsmedicinen Losec. Det är sen tidigare känt att detta ämne ökar HDC-aktiviteten. I fortsatta försök, ökade vi aktiviteten och därmed mängden HDC med omeprazole, och stoppade sedan tillverkningen av HDC med en sk. hämmare. Resultatet visade att 74 kDa och 54 kDa försvann långsamt medan 63 kDa försvann i samma takt som aktiviteten försvann. Sammantaget är detta intressanta fynd då det verkar som om 63 kDa är en viktig form tillsammans med 54- och 74 kDa-HDCet.



Frågan är om enzymet ursprungligen bildas i en storlek varefter olika faktorer, som t.ex. gastrin, påverkar HDCet till att klyva av en bit för att detta ska kunna bli aktivt i cellen? Sker då detta i två steg från 74 till 63 som sedan omvandlas till 54, eller är 54 kDa HDCet en nedbrytningsprodukt som bildas?



Många frågor måste besvaras innan vi riktigt vet hur HDC regleras i cellen och i olika delar av kroppen. Vår forskning utgör viktig och relevant kunskap eftersom histamin som tidigare nämnts är en substans, som förekommer i samband med olika sjukdomar och som man på olika sätt vill hindra att verka. Hittills har man med hjälp av olika läkemedel, så kallade antihistaminer, försökt att hindra histamin från att binda till cellen och därmed utöva sin effekt. I ett längre perspektiv kan ett mål vara att hindra HDC-aktiveringen och därmed stoppa den skadliga tillverkningen av histamin.

• author: Dartsch, Christine
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Doc Mattsson, Mats-Olof, Institutionen för zoofysiology, Umeå Universitet
• organization: Department of Experimental Medical Science
• publishing date: 1998
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Developmental Biology
• keywords: Physiology, omeprazole, antiserum, fetal rat liver, COS-7 cells, purification, bacterial expression, protein turnover, ECL cells, gastric mucosa, gastrin, histdine decarboxylase, histamine, Fysiologi, Proteins, enzymology, Proteiner, enzymologi
• pages: 87 pages
• defense location: Fernströmsalen, Sölvegatan 19, Lund
• defense date: 1998-09-26 09:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMED/MEFN--19--SE
• ISBN: 91-628-3074-0
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Molecular and Cellular Physiology (ceased) (LUR000011)
• id: afbda3ba-e547-4848-a541-6b500bfb4df4 (old id 38862)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:24:52
• date last changed: 2018-11-21 21:04:42