Extracorporeal immunoadsorption

Abstract

Antibodies are important protein structures in the immunological defence. Occasionally the regulation of the production of these antibodies fails and antibodies directed against self structures are produced in large scale. Antibody production can also complicate or make transfusions and transplantations impossible. Purified protein A from Staphylococcus aureus immobilised to beaded agarose can adsorb these antibodies. This thesis demonstrates the development of extracorporeal immunoadsorption systems, including columns and monitors, used for elimination of antibodies in cancer patients and in haemophilia patients with inhibitors. The treatment of cancer failed but the experience of a full-scale adsorption system was gained. In haemophilia patients with inhibitors immunoadsorption for elimination of inhibitors has become an important part to achieve haemostasis in acute bleedings or in prophylactic treatment prior to planned surgery. Presented is the results of the treatment in 10 haemophilia patients during 19 different occasions with immunoadsorption. In all cases except one haemostasis could be obtained for more than 5 days. Immunoadsorption has also been involved in a tolerance protocol, the Malmö treatment model, being the process to eradicate the production of inhibitors. Immunoadsorption has been used in patients having high titre of inhibitor at start of tolerance protocol. Presented is the results of 36 treatments in 23 haemophilia patients. Tolerance was induced in 16 of the patients. Immunoadsorption has become an accepted form of treatment, shown efficient in elimination of antibodies in patients with many different diseases.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Bakgrund



Kroppen har många olika försvarsmekanismer för att skydda sig mot angrepp av olika slag. Bland försvarsmekanismerna i immunförsvaret finns förmågan att bilda antikroppar. Antikroppar, eller immunglobulin, är lösliga protein och består av fyra polypeptidkedjor som hålls samman av svavelbindningar. Dessa kedjor har en variabel ände som ger upphov till molekylens reaktivitet med olika antigen (Fab-del). Den andra änden av molekylen har en, av ett fåtal möjliga, konstanta strukturer (Fc-del). Beroende av den konstanta änden kan antikroppar delas in i flera olika klasser och subklasser.



Storskalig produktion av antikroppar initieras av exposition av antigen. Kroppen förhindrar antikroppsproduktion mot individens egna strukturer. Av okänd anledning fungerar spärren inte alltid, utan kroppen kan producera antikroppar mot egna strukturer, vilket resulterar i så kallade autoimmuna sjukdomar. I fall av autoimmuna sjukdomar och fall där antikroppar komplicerar sjukvård t.ex. vid transplantationer, finns ett behov av att eliminera antikroppar.



Protein A och behandling av cancer



Ett litet antal mikroorganismer har med evolutionens hjälp utvecklat immunglobulinbindande cellstrukturer. Protein A, är en cellväggsstruktur som förekommer hos bakterien Staphylococcus aureus. Detta protein kan binda immunglobulin av skilda slag. Kolonner fyllda med antingen hela avdödade bakterier med protein A eller renat och immobiliserat protein A, har använts för extrakorporeal adsorptionsbehandling av cancerpatienter.



Patientbehandlingarna föregicks av försök på katter och hundar med olika former av cancer. Framför allt var resultaten vid behandling av katter med Feline leukemi mycket positiva. Dessa katter kunde helt botas från sin leukemi. Det fanns andra studier som indikerade att antigen som släppte från tumörceller bildade immunkomplex med de antikroppar som försökte döda cancercellerna och att dessa immunkomplex hämmade vidare aktiviteter inom immunförsvaret. Protein A syntes dessutom ha större benägenhet att binda immunkomplex än fria antikroppar. Olika modeller av kolonner innehållande protein A bundet till kulformad agaros utvecklades. Kolonnerna användes i ett recirkulerande extrakorporealt system och var antingen avsedda för helblodspassage eller processandet av plasma. Kolonnerna var långa och smala och innehöll mellan 150 och 200 ml Protein A Sepharose®, vilket gav en bindningskapacitet om 3 respektive 4 gram immunglobulin.



I Lund behandlades 6 cancerpatienter med immunadsorption. Patienterna hade olika former av spridd cancer i slutstadiet. Vid varje behandling processades 1,5 till 3 liter plasma över en eller två kolonner med protein A Sepharose. Mellan behandlingarna avlägsnades de till kolonnerna bundna immunglobuliner och immunkomplex genom eluering med lågt pH. Behandlingen visade sig ha högst begränsad, om någon, effekt på tumörerna. Senare studier har visat att det var läckage av små mängder av andra bakteriesubstanser, så kallade enterotoxiner, som var den verksamma mekanismen bakom de positiva resultaten i tidigare studier. Den form av leukemi som katterna hade är dessutom speciellt känslig för dessa enterotoxiner. Kolonner med rent protein A saknade enterotoxiner som fanns rikligt i kolonner med avdödade bakterier vilka använts vid kattbehandlingarna.



Första behandlingen av hemofili med inhibitorer



Intresset för immunadsorption förnyades då en patient med hemofili med inhibitorer behövde genomgå operation. Hemofili, blödarsjuka, är en genetiskt överförd bristsjukdom där patienten inte producerar något eller tillräckligt av koagulationsfaktorerna VIII eller IX. Sjukdomen kallas hemofili A om bristen föreligger på faktor VIII och hemofili B om bristen föreligger på faktor IX. Sjukdomen är könsbunden så att kvinnor kan vara bärare av den genetiska defekten medan det endast är män som drabbas av bristsjukdomen. Idag behandlas hemofili med substitution av koagulationsfaktorer i koncentrerad form som renats fram från donatorplasma. Vissa patienter bildar antikroppar i samband med denna behandling. Vid hög titer omöjliggör dessa antikroppar vidare behandling då de inhiberar effekten av givna koagulationsfaktorer. Endast en liten mängd antikroppar/inhibitorer kan neutraliseras med större mängd koagulationsfaktor.



Patienten, som var i starkt behov av behandling på grund av en så kallad pseudotumör, var en 37-årig man som hade svår hemofili B med hög titer inhibitorer. Titern behövde sänkas till betydligt under hälften för att funktionella nivåer av koagulationsfaktorer skulle kunna erhållas med givna koncentrat. Från denna patient måste därför mycket stora mängder immunglobulin elimineras. Strategin för immunadsorption fick ändras. En ny monitor konstruerades, där man både kunde utföra adsorption över kolonnen samt regenerera den. Utrustningen dubblerades så att två kolonner kunde användas parallellt. Bindningskapaciteten blev därmed ?oändlig?.



Patienten behandlades under två dagar varvid 1,5 till 2 plasmavolymer processades. Mer än 75% av immunglobulinet och därmed inhibitorerna eliminerades. Tillräckligt med koagulationsfaktor kunde ges och operationen utfördes utan problem. Hög titer av koagulationsfaktor kunde upprätthållas under ytterligare 7 dagar och såren läkte väl. Efter 7 dagar hade inhibitorer producerats till sådan titer att de inte längre kunde neutraliseras.



The Malmö treatment model



Två år senare behövde samma patient ånyo behandling. Denna gång hade patienten en infekterad cysta i käkbenet. Inhibitortitern hade visserligen sjunkit jämfört med toppvärdet men var ändå för hög för neutralisering med enbart faktorkoncentrat. Under en dags intensiv behandling processades därför 4,7 liter plasma i adsorptionssystemet och både inhibitortitern och immunglobulintitern minimerades. Patienten fick immunglobulin för att minska infektionsrisken vid öppnandet av den infekterade cystan, i övrigt var behandlingen lik den förra. Operationen gick väl och både bencystan och 8 tänder togs bort och alla sår läkte utan problem. Den förväntade inhibitorproduktionen uteblev. Det visade sig att kombinationen av immunadsorption, givandet av faktorkoncentrat, immunsuppressiva droger och intravenöst gammaglobulin hade skapat så kallad tolerans hos patienten. Patienten kunde i fortsättningen erhålla faktorkoncentrat i profylaktiskt syfte och därmed undvika svåra blödningar. Patienten har nu varit tolerant i mer än 16 år. Detta var första behandlingen i vad som kom att kallas The Malmö treatment model.



Immunadsorptionsutrustningen utvecklades vidare både på maskin/monitor sidan och kolonnsidan. Denna nya monitorn döptes till Citem 10® och den nya 62,5 ml stora kolonnen till Immunosorba®. Denna utrustning blev ännu effektivare i att processa plasma. Man kan nu behandla plasma i flöden upp till 50 ml/min, snabbt och effektivt ta bort immunglobulin utan att bli av med andra värdefulla plasmakomponenter. Detta medför att skadliga antikroppar kan elimineras utan att humana ersättningsprodukter behöver ges och därmed undanröjs risken för överförande av många allvarliga ?blodburna? smittor.



Specifik helblodskolonn



Det är endast en liten del av immunglobulinet som är skadliga eller komplicerande antikroppar. I fall av hemofili med inhibitorer vet man dessutom exakt vad antikropparna är riktade mot. En specifik helblodskolonn utvecklades genom att kemiskt koppla ren och koncentrerad koagulationsfaktor IX till kulad agaros. Eftersom kolonnen inte var avsedd att elueras under behandlingen gjordes kolonnen för helblod. Man behövde därmed endast en enkel behandlingsutrustning men det krävdes att kolonnen hade mycket hög bindningskapacitet.



Den förste patienten som behandlades var en 10-årig pojke med svår hemofili B och med hög titer inhibitorer. Pojken hade haft en mängd återkommande ledblödningar, var allvarligt handikappad och behövde nu en ortopedisk operation av vänster knä. Under två dagar behandlades patientens dubbla blodvolym över de specifika kolonnerna och därigenom kunde inhibitortitern sänkas till en med faktorkoncentrat neutraliserbar nivå. Operationen gick väl och efterföljande läkning var helt odramatisk. Efter 7 dagar var inhibitortitern åter hög, dock blev den inte lika hög som före behandlingen.



Helblodsbehandling utan eluering under behandlingen är enkel att utföra men kostnaderna för kolonnerna blir mycket höga. Specificiteten verkar inte ha några kliniska fördelar varför immunadsorptionssystemet med protein A innehållande kolonner är att föredra. Samma utrustning kan då användas för behandling av patienter med ett stort antal olika diagnoser där en antikropp komplicerar eller medierar sjukdomen.



Behandling av hemofili med inhibitorer



Immunadsorption har frekvent använts i behandlingen av hemofiliker med inhibitorer. Dessa behandlingar har skett dels i samband med akuta blödningar och vid planerade operativa ingrepp dels som en del i The Malmö treatment model för att skapa tolerans hos patienterna. Under perioden 1980 - 1995 har 19 immunadsorptionsbehandlingar utförts i Malmö-Lund-regionen. I samtliga fall utom ett har man med efterföljande faktorbehandling lyckats hålla adekvat hög nivå av koagulationsfaktor i mer än 5 dagar; tid nödvändig för sårläkning. Den yngsta pojken som behandlats var 5 år och vägde endast 17 kilo.



I samband med The Malmö treatment model, där man försöker inducera tolerans, krävs endast immunadsorptionsbehandling om inhibitortitern är hög. De övriga komponenterna, cyklofosfamid (immunsuppressiv drog), intravenöst gammaglobulin och faktorkoncentrat är obligatoriska. Totalt har 23 hemofiliker behandlats enligt protokollet; sexton av dessa hade hemofili A och 7 hemofili B. Av dessa är nu 10 (62,5%) av A-patienterna och 6 (86%) av B-patienterna toleranta. I flera fall lyckades man inte inducera tolerans vid första försöket utan behandlingen fick upprepas. Totalt har 36 försök utförts, vilket betyder att man vid cirka varannan behandling lyckats skapa tolerans. Studier av olika patient- och behandlingsparame

• author: Freiburghaus, Christian
• supervisor: Anders Grubb
• opponent: Prof Aledort, Louis, Mount Sinai School of Medicine, New York, USA
• organization: Division of Clinical Chemistry and Pharmacology
• publishing date: 1998
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medicinal Chemistry; Pharmacology and Toxicology
• keywords: Immunology, Klinisk kemi, Clinical chemistry, tolerance induction, inhibitors, haemophilia, Extracorporeal immunoadsorption, antibody elimination, serology, transplantation, Immunologi, serologi
• pages: 100 pages
• defense location: University Hospital, Föreläsningssal 3
• defense date: 1998-10-09 13:00:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MECL-1015-SE
• ISBN: 91-628-3132-1
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 631fa57b-2abf-4c48-a186-4800f095ca4f (old id 38882)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:26:03
• date last changed: 2022-03-14 07:52:44