Injury-induced activation of vascular smooth muscle cells. Role of specific gene expression and intracellular signalling pathways

Abstract

Migration and proliferation of smooth muscle cells (SMC) are important events in the development of atherosclerosis and restenosis following angioplastic surgery. It is important to gain further knowledge about the mechanisms regulating SMC form and function in order to understand the underlying disease process. In this thesis I have used cultured rat aortic SMC and analysed how these cells respond to either a mechanical or enzymatic injury. The objective has been to identify the molecular mechanisms involved in injury-induced activation of SMC. I have focused my studies on the role of molecules regulating migration and proliferation. These include metalloproteinases and the intracellular signalling molecule ERK1/2. Increased expression of the migration-related stromelysin gene as well as early and transient expression of the transcription factor Ets-1 were detected when primary SMC were established in culture. Up-regulated Ets-1 expression was also seen in the rat carotid artery following balloon-injury. Since Ets-1 regulates the stromelysin gene, the role of stromelysin in injury-induced SMC activation was further investigated using antisense oligonucleotides directed towards the stromelysin translation initiation site. Treatment with antisense oligos inhibited phenotypic change as well as decreased the migration and proliferation of SMC after injury in vitro. Furthermore, these antisense oligos reduced neointimal thickening after balloon-injury in rat carotid arteries. Injury-induced ERK1/2 phosphorylation could be coupled to altered SMC function by the use of the MEK1-inhibitor PD98059. In addition, the synthetic metalloproteinase inhibitor Batimastat (BB94) reduced ERK1/2 activation as well as SMC migration and proliferation. Further studies demonstrated that Ca2+, calmodulin, tyrosine kinases, G-proteins and Src all appear to be involved in injury-induced ERK1/2 activation, migration and proliferation in SMC. In conclusion, these results suggest (1) a role for Ets-1 and metalloproteinases such as stromelysin in the SMC response to injury, (2) that the ERK1/2 is a key signalling molecule in the alteration of SMC function, (3) that release of Ca2+ is necessary for optimal ERK1/2 activation, and (4) that SMC activation due to injury is a result of signal transmission via several converging ERK1/2 connected pathways.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Den vanligaste dödsorsaken i västvärlden är hjärt-kärlsjukdom. Därför finns det ett stort intresse att undersöka vilka faktorer som är av avgörande betydelse för att vi ska utveckla t.ex ateroskleros (åderförkalkning). Spelar livsstil och matvanor någon roll eller är det helt och hållet genetiskt betingat? Utvecklingen av förebyggande åtgärder, operationsteknik och postoperativ behandling har gått snabbt de senaste åren, men det behövs mycket mer kunskap för att vi ska förstå de komplexa sambanden mellan olika celltyper och substanser i hjärt-kärlsystemet.



Redan i sjuårsåldern börjar hos oss alla en långsam inlagring av fett i kärlväggen. Hos vissa personer utvecklas fettrika områden till s.k fibrösa plack som består av döda celler och oxiderat fett. Ett sådant kan, många år senare, till slut täppa till hela kärlet, men vanligare är att det redan tidigare lossnar, förs med blodflödet till ett trängre ställe t.ex hjärtats kranskärl eller i hjärnan där det fastnar och orsakar syrebrist - en infarkt. I kärlet där placket suttit startar en sårläkningsprocess som innebär att koagulationsfaktorer samlas, vilket i sin tur också kan orsaka en tilltäppning av kärlet s.k trombos. Blodproppar och tidigare stadier av förträngningar kan behandlas med kirurgi, bl.a genom att föra in en ”ballong” som får expandera i kärlet, trycker tillbaka utbuktningen och därmed vidgar kärlet. Den här metoden är etablerad men har en nackdel. I över hälften av alla ballongvidgade kärl bildas en restenos (sekundär förträngning) som i stället består av nybildade och invandrade glattmuskelceller (den sortens muskelceller som gör blodkärl och tarmar elastiska) tillsammans med nybildad bindväv. Glattmuskelcellerna i de yttre lagren uppfattar alltså tryck och skador i det inre celllagret (lagret närmast blodflödet) som en signal att starta en sårläkningsprocess som dock fortsätter ohämmat även en tid efter att skadade celler har blivit ersatta. Hur aktiveras glattmuskelcellerna under de här omständigheterna? Går aktiveringen att bromsa på ett kontrollerat sätt? Vad har den omgivande bindvävens sammansättning för betydelse? Dessa frågor försöker den här avhandlingen belysa!



För att celler ska kunna bilda en vävnad måste de hållas ihop av s.k extracellulär matrix, ett nätverk av proteiner och polysackarider (sockerkedjor), som ger karaktäristisk form, stabilitet och flexibilitet. Kärlväggens matrix består till stor del av bl.a kollagen, gelatin och elastin. De är alla molekyler som bildar fiberlika strukturer och de ger tillsammans med glattmuskelcellerna kärlet dess förmåga att anpassa sig efter snabba blodtrycks- och temperaturändringar. Glattmuskelcellerna kan producera både matrixproteiner, matrixmetalloproteinaser (matrixnedbrytande enzymer) och olika tillväxtfaktorer. I normala kärl är glattmuskelcellerna vilande men kontraktila, d.v.s har utpräglade muskelegenskaper. Efter kärlskada genomgår de en serie förändringar och blir istället syntetiserande celler som påbörjar celldelning, får ökad rörlighet och producerar matrixnedbrytande metalloproteinaser bl.a.



I det första arbetet valde vi att kartlägga om och hur länge vissa tillväxtrelaterade gener uttrycks i glattmuskelceller odlade i kultur. Det har nämligen tidigare visats att de under första veckan i cellkultur genomgår samma omvandling från kontraktila till aktiva ”reparationsceller” som efter kärlskada, vilket gör det möjligt att använda cellkulturer som kompletterande modellsystem. Både på RNA- och proteinnivå kunde vi se en tidig och snabbt övergående ökning av produkter från flera tillväxtreglerande gener, följt av produktion av matrix metalloproteinaset stromelysin och tillväxtfaktorer. Därefter undersöktes förekomsten och regleringen av en av generna, som i sin tur reglerar bl.a tillverkningen av stromelysin. Ballongskada gjordes i aorta i råttor, varefter kärlen togs ut olika lång tid efter skada och analyserades. En kraftig ökning av proteinet kunde observeras två timmar efter skada.



Förhindrad produktion av ett protein eller hämning av ett redan aktivt protein är en viktig regleringsmekanism såväl naturligt i kroppens celler som med vissa läkemedel. I det tredje arbetet undersökte vi om det är möjligt att hämma syntes av stromelysin genom att tillföra syntetiskt DNA med en sådan sekvens att det binder till och täcker det RNA-område som annars skulle utgöra mallen för syntes av stromelysinproteinet (s.k antisenseteknik). Detta utifrån tillsatta DNA kan tas upp genom cellmembranet och även om en del hinner brytas ned kan man räkna med att en tillräckligt stor del når fram till sitt målRNA. Hämning av stromelysin genom att låta en lösning med antisense-DNA verka lokalt i kärlet direkt efter att ballongskada gjorts visade sig minska celldelning och bildning av de nya tjocka lagren av glattmuskelceller i kärlet med ca 60%!



I en parallell studie testade vi effekter av den syntetiska metalloproteinasinhibitorn Batimastat. Denna substans verkar genom att binda till matrix metalloproteinaser och därigenom förhindra dem att bryta ned matrixproteinerna. Batimastat har mest använts i cancerstudier för att hämma matrixnedbrytning, som är ett viktigt steg i bildningen av metastaser. Andra grupper har visat att den också har hämmande effekt på tilltäppning efter kärlkirurgi i djur. Vi fann att ERK (extracellular regulated kinase), ett nyckelprotein i en av de viktigaste signaleringskaskaderna som förmedlar signaler från omgivningen in till cellkärnan, hämmades kraftigt redan fem minuter efter skada. Det är långt innan man ser bromsning av metalloproteinasernas aktivitet, vilket tyder på att Batimastat kan binda till molekyler på cellytan också. Det femte arbetet går ytterligare in på vilka signalvägar som kan vara mest inblandade i aktiveringen av glattmuskelcellerna i samband med skada och huruvida förankring i extracellulär matrix är styrande.



Sammanfattningsvis beskriver den här avhandlingen hur skador i kärlväggen kan påverka de glatta muskelcellernas beteende, med avseende på rörlighet, celldelning och syntes av några viktiga matrixmolekyler. Vidare har olika hämmare använts för att undersöka om den snabba celltillväxten efter kärlkirurgi kan minskas. Resultaten kan förhoppningsvis få klinisk betydelse i förlängningen.

• author: Lövdahl, Cecilia
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Newby, Andrew
• organization: Rheumatology
• alternative title: Aktivering av glattmuskelceller vid kärlskada
• publishing date: 2000
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Rheumatology and Autoimmunity
• keywords: metalloproteinase, extracellular matrix, ERK1/2 signalling, migration, proliferation, injury, vessel wall, smooth muscle cell, Medicine (human and vertebrates), Medicin (människa och djur)
• pages: 126 pages
• defense location: Kemicentrum, lecture hall C
• defense date: 2000-10-20 13:00:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MECM--00/1048--SE
• ISBN: 91-628-4209-9
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Connective Tissue Biology (013230151)
• id: 4aacc868-db8d-4dce-877a-a51ae34d2160 (old id 40741)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:33:17
• date last changed: 2018-11-21 20:59:25