Advanced

Sesquiterpene synthases in Artemisia annua: Cloning, Expression, and Characterisation of the Recombinant Enzymes

Mercke, Per LU (2000)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

Extrakt från växten Artemisia annua har dokumenterats för sina anti-malaria egenskaper. Substansen är en mycket effektiv medicin mot malaria och hjälper även mot de former där multi-resistens utvecklats.1979 presenterades strukturen på den aktiva substansen. Den benämns artemisinin och är uppbygd av femton kol innehållandes en peroxid-brygga (två syre kopplade till varandra), vilken har visat sig vara central för molekylens aktivitet mot malaria. Artemisinin tas upp av parasiten som orsakar malaria. Inne i parasitens matsmältnings organ bryts bryggan och oxidativa radikaler dödar parasiten innefrån. Artemisinin är mycket svår att kemiskt syntetisera och det artemisinin som finns på marknaden idag... (More)
Popular Abstract in Swedish

Extrakt från växten Artemisia annua har dokumenterats för sina anti-malaria egenskaper. Substansen är en mycket effektiv medicin mot malaria och hjälper även mot de former där multi-resistens utvecklats.1979 presenterades strukturen på den aktiva substansen. Den benämns artemisinin och är uppbygd av femton kol innehållandes en peroxid-brygga (två syre kopplade till varandra), vilken har visat sig vara central för molekylens aktivitet mot malaria. Artemisinin tas upp av parasiten som orsakar malaria. Inne i parasitens matsmältnings organ bryts bryggan och oxidativa radikaler dödar parasiten innefrån. Artemisinin är mycket svår att kemiskt syntetisera och det artemisinin som finns på marknaden idag utvinns ifrån växten A. annua. Mängden artemisinin man får ut från växten är mycket låg vilket således ger ett mycket högt pris.



Genom att studera och lära oss om växtens biosyntes av artemisinin hoppas vi att kunna hitta och öppna de flaskhalsar som hindrar växten att tillverka mer artemisinin. A. annua tillverkar flera olika substanser från samma utgångs material (substrat) som används till artemisinin. Genom att öka andelen av det materialet som går till artemisinin, bör ett större utbyte av detta ämne erhållas ur växten. Med genteknik kan man öka hastigheten av långsamma steg i växtens biosyntes. Man kan också ”stänga av” vissa gener som använder ett visst substrat till en oönskad produkt. Den typ av enzymer som utför det första steget av artemisinin syntesen är även intressanta i sig. De kallas för seskviterpen syntaser. Ur ett och samma substrat kan över 300 olika strukturer bildas. Hur dessa enzymer kan styra en reaktion till en specifik produkt är fortfarande oklart. Genom att klona seskviterpen syntaser kan man producera stora mängder av detta enzym i exempelvis bakterier. Detta gör det möjlig att studera och ta fram data om hur seskviterpen syntaser fungerar.



Denna avhandling diskuterar terpen biosyntesen i allmänhet och särskilt i A. annua. Vidare, beskriver den kloning och enzym produktion i bakterier av två gener som använder det substrat som kan bli till artemisinin. Den ena genen gör ett enzym som troligen utför det första steget i växtens biosyntesen av artemisinin. Ett modell system som skulle kunna styra substrat flödet mot artemisinin behandlas också. (Less)
Abstract
Plants produce a multitude of different compounds that may have biotic effects. Artemisia annua, produces a compound used as a drug against multi-drug-resistant strains of Plasmodium falciparum, the parasite causing malaria. The compound, artemisinin, is a sesquiterpene and is an essential component for the production of artemisinin drugs against malaria. In a first critical step of the biosynthesis of artemisinin, a sesquiterpene carbon structure is formed from the substrate farnesyl diphosphate. Enzymes catalysing sesquiterpene formation, are called sesquiterpene synthases. The common substrate farnesyl diphosphate may, enzymatically, be converted to over 300 different sesquiterpene hydrocarbons. Sesquiterpene synthases are thought to be... (More)
Plants produce a multitude of different compounds that may have biotic effects. Artemisia annua, produces a compound used as a drug against multi-drug-resistant strains of Plasmodium falciparum, the parasite causing malaria. The compound, artemisinin, is a sesquiterpene and is an essential component for the production of artemisinin drugs against malaria. In a first critical step of the biosynthesis of artemisinin, a sesquiterpene carbon structure is formed from the substrate farnesyl diphosphate. Enzymes catalysing sesquiterpene formation, are called sesquiterpene synthases. The common substrate farnesyl diphosphate may, enzymatically, be converted to over 300 different sesquiterpene hydrocarbons. Sesquiterpene synthases are thought to be regulatory enzymes for the intracellular carbon metabolic flux in plants. Epi-cedrol synthase and amorpha-4,11-diene synthase have been cloned from Artemisia annua. The cDNA for these clones have been expressed in E. coli and the recombinant enzymes have been identified and characterised. Recombinant epi-cedrol synthase catalyses the formation of both olefinic (3%) and oxygenated (97%) products from farnesyl diphosphate. The major product formed by this enzyme is 8-epi-cedrol. The other recombinant enzyme catalyses the synthesis of amorpha-4,11-diene, as a major product. Amorpha-4,11-diene has the correct structure to be the precursor for artemisinin. A reaction mechanism starting with a C1,C6 closure is proposed for both recombinant terpene synthases. Both recombinant enzymes demonstrate kinetic characteristics comparable to other cloned sesquiterpene synthases. Fusing the open reading frames of farnesyl diphospahte synthase and epi-aristolochene synthase (a sesquiterpene synthase from tobacco) in different orders resulted in two bifunctional enzymes. The stop codon of the N-terminal enzyme was removed and replaced by a short peptide (G-S-G) to introduce a linker between the two open reading frames. A channeling of the intermediate farnesyl diphosphate by the bifunctional enzymes was established. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
opponent
  • Prof Chappell, Joe
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
Artemisia annua, Sesquiterpene synthases, artemisinin, Plant biochemistry, Växtbiokemi
pages
120 pages
publisher
Per Mercke, Spolegatan 3a, 222 20 Lund
defense location
Room 213, dep of Plant Biochemistry
defense date
2000-01-01 10:15
external identifiers
  • Other:ISRN: LUNKDL/NK VK-00/1019
ISBN
91-973252-8-7
language
English
LU publication?
yes
id
bc8bf0e3-5654-4815-af3d-93fd320443b3 (old id 40792)
date added to LUP
2007-08-01 14:47:13
date last changed
2016-09-19 08:45:08
@misc{bc8bf0e3-5654-4815-af3d-93fd320443b3,
  abstract     = {Plants produce a multitude of different compounds that may have biotic effects. Artemisia annua, produces a compound used as a drug against multi-drug-resistant strains of Plasmodium falciparum, the parasite causing malaria. The compound, artemisinin, is a sesquiterpene and is an essential component for the production of artemisinin drugs against malaria. In a first critical step of the biosynthesis of artemisinin, a sesquiterpene carbon structure is formed from the substrate farnesyl diphosphate. Enzymes catalysing sesquiterpene formation, are called sesquiterpene synthases. The common substrate farnesyl diphosphate may, enzymatically, be converted to over 300 different sesquiterpene hydrocarbons. Sesquiterpene synthases are thought to be regulatory enzymes for the intracellular carbon metabolic flux in plants. Epi-cedrol synthase and amorpha-4,11-diene synthase have been cloned from Artemisia annua. The cDNA for these clones have been expressed in E. coli and the recombinant enzymes have been identified and characterised. Recombinant epi-cedrol synthase catalyses the formation of both olefinic (3%) and oxygenated (97%) products from farnesyl diphosphate. The major product formed by this enzyme is 8-epi-cedrol. The other recombinant enzyme catalyses the synthesis of amorpha-4,11-diene, as a major product. Amorpha-4,11-diene has the correct structure to be the precursor for artemisinin. A reaction mechanism starting with a C1,C6 closure is proposed for both recombinant terpene synthases. Both recombinant enzymes demonstrate kinetic characteristics comparable to other cloned sesquiterpene synthases. Fusing the open reading frames of farnesyl diphospahte synthase and epi-aristolochene synthase (a sesquiterpene synthase from tobacco) in different orders resulted in two bifunctional enzymes. The stop codon of the N-terminal enzyme was removed and replaced by a short peptide (G-S-G) to introduce a linker between the two open reading frames. A channeling of the intermediate farnesyl diphosphate by the bifunctional enzymes was established.},
  author       = {Mercke, Per},
  isbn         = {91-973252-8-7},
  keyword      = {Artemisia annua,Sesquiterpene synthases,artemisinin,Plant biochemistry,Växtbiokemi},
  language     = {eng},
  pages        = {120},
  publisher    = {ARRAY(0x79f48f8)},
  title        = {Sesquiterpene synthases in Artemisia annua: Cloning, Expression, and Characterisation of the Recombinant Enzymes},
  year         = {2000},
}