Mechanisms of insulin exocytosis and release

Abstract

Endocrine cells as well as neurons release their hormones and transmitters by regulated exocytosis. In the pancreatic B-cell, stimuli like glucose initiate biochemical and electrical processes that culminate in influx of Ca2+, which then triggers exocytosis of insulin-containing granules. Fusion of the secretory vesicles occurs rapidly upon Ca2+-influx but requires a granule to be ?primed? by an ATP-, Ca2+- and temperature-dependent reaction. Only a small fraction of the B-cell's granules (~ 0.5 %) are in the primed state and can undergo exocytosis immediately upon Ca2+-influx. These granules are referred to as the readily releasable pool (RRP), whereas the remaining granules form a ?reserve? pool. The functional organization of the granules in a reserve pool and a readily releasable pool could account for the fact that glucose-stimulated insulin secretion follows a biphasic time course, with the early rapid component (1st phase secretion) corresponding to RRP release and the second slower component reflecting time- and ATP-dependent mobilization of granules from the reserve pool. The commonest form of human diabetes (type-2 diabetes) is associated with disturbances in this release pattern. In this thesis, electrophysiology, fluorescence microscopy and biochemistry were combined to explore mechanisms of granule trafficking, priming, exocytosis, and release in insulin-secreting B-cells. Three aspects are discussed in detail: 1) The importance of a tight interaction between L-type Ca2+-channels and the exocytotic machinery for efficient secretion; 2) A novel ATP-dependent priming reaction that is regulated by a granular 65-kDa sulfonylurea-binding protein, and involves granule acidification and ClC-3 chloride channels; and 3) A previously overlooked delay between fusion of the granule with the plasma membrane and insulin release. Since regulated secretion is very similar in all (neuro)-endocrine cells, the data obtained are likely to be relevant for peptide secretion in general.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Insulin frisätts från B-cellerna i bukspottkörteln (pankreas) när blodsockerhalten ökar över den normala (80-100 mg per dl), exempelvis efter en kolhydrat- och sockerrik måltid. Medan ?friska? B-celler har förmågan att reagera kraftigt redan på små (10%) förändringar i blodsockerhalten, så utvecklar ?ålders-diabetiska? B-celler en blodsockerblindhet och insulinfrisättningen ökar inte tillräckligt för att balansera det ökade insulinbehovet. Inuti den insulinfrisättande B-cellen lagras insulin i ett stort antal små lagringsblåsor. Insulinblåsorna kan ses som en såpbubbla innehållande en kristall av insulin. För att insulin skall kunna utöva sin biologiska verkan måste dessa lagringsblåsor sammansmälta med den omgivande cellväggen (cellmembranet). Varje B-cell innehåller fler än 10 000 sådana insulinblåsor men endast en bråkdel (0,5%) av dessa är omedelbart frisättningsbara. En ökad kalciumkoncentration inuti B-cellen till följd av ett stimulerat kalciuminflöde är den signal som igångsätter frisättningen av insulin. Kalcium transporteras in i cellen genom ett speciliserat transportprotein som bildar en vattenfylld kanal genom cellväggen, s.k. kalciumkanaler. Avhandlingens första del undersöker förhållandet mellan dessa kalciumkanaler och insulinblåsorna. En viktig slutsats av detta arbete är att insulinblåsorna och kalciumkanalerna bildar en funktionell enhet. Detta gör att insulinblåsorna kan sammansmälta med cellmembranet mycket snabbt (inom en hundradels sekund) vid stimulering av insulinfrisättningen samtidigt som energiåtgången för att återställa kalciumhalten till vilonivån minimeras. En serie kemiska reaktioner är nödvändig för att göra insulinvesikeln frisättningskompetent. Avhandlingens andra huvudtema är undersökningar av dessa förlopp. Sådana undersökningar är viktiga eftersom störningar i dessa reaktioner kan tänkas medföra minskad insulinfrisättning, t.ex. den som uppträder vid åldersdiabetes. Vi har identifierat ett nytt och, som det förefaller, avgörande steg i utmognadsprocessen som medverkar i en surgörning (d.v.s. en sänkning av pH:t) av insulinblåsornas inre. Ett komplex av åtminstone tre äggviteämnen (proteiner) deltar i förloppet och skulle vara en ideal måltavla för nya blodsockersänkande diabetesmediciner. Intressant nog har vissa nu använda diabetesmediciner som ?biverkan? att de påverkar just utmognadsprocessen och surgörningen av blåsorna. En förhoppning är att vi genom att karakterisera dessa processer skall kunna ?skräddarsy? nya läkemedel som selektivit påverkar just dessa processer. I det avslutande arbetet har vi utvecklat tekniker som medger undersökningar av lagringsblåsorna inuti cellen innan insulin frisätts. De tekniker som hittills använts av oss och andra har endast medgivit undersökningar av det sista steget, d.v.s. uppträdandet av insulin utanför cellen eller blåsornas sammansmältning med cellmembranet. För att förstå hur insulin frisätts och vad som avgör lagringsblåsornas frisättningsförmåga är det naturligtvis viktigt att undersöka de tidigare stegen. Något tillspetsat kan man kanske säga att uppfattningen att man kan förstå insulinsekretionens reglering genom att enbart mäta insulin är lika naivt som att tro att man kan förstå hur en bil fungerar genom att undersöka vad som kommer ur avgasröret! Med hjälp av en teknik där vi gör insulinblåsorna fluorescerande (d.v.s. de utsänder ljus) har vi kunnat visa att enbart insulinblåsor som sitter fast vid cellmembranet frisätts i samband med stimulering. Vi visar också att antalet blåsor som sitter fast vid membranet väsentligt överstiger det antal som vid ett givet tillfälle kan frisättas varför regleringen av insulinfrisättningen till stor del kan ske genom att blåsornas frisättningsbarhet ökas eller minskas. Någon fysisk transport av vesiklar inuti cellen är alltså inte nödvändig, åtminstone inte i det korta perspektivet (<10 min). Vi har också kunnat visa att själva frisättningen av insulin är mycket (100-1000 gånger) långsammare än lagringsblåsornas sammansmältning med cellmembranet. Denna fördröjning beror på att det tar en viss tid (1-10 s) för att öppningen i membranet (fusionsporen) skall vidgas tillräckligt för att den i sammanhanget ganska stora insulinmolekylen (~0,000004 mm) skall kunna passera. Det framstår som troligt att en liknande fördröjning även sker i andra cellslag där äggviteämnen frisätts. Exempel på sådana celler är andra hormonproducerande celler men även frisättningen av s.k. neuropeptider i nervsystemet. Det är nu väsentligt att undersöka vad som normalt reglerar fusionsporen öppnande samt om denna process kan påverkas farmakologiskt.

• author: Barg, Sebastian
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Lang, Jochen, Bordeaux
• organization: Islet cell physiology (research group)
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Endocrinology and Diabetes
• keywords: ClC-3, electrophyiology, confocal microscopy, calcium channel, readily releasable pool, exocytosis, insulin, diabetes, green fluorescent protein, Physiology, Fysiologi
• pages: 100 pages
• defense location: Segerfalksalen BMC Sölvegatan 17
• defense date: 2001-04-11 13:00:00
• ISBN: 91-628-4676-0
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 1b26763f-fb4e-4459-b893-1dc4029d58ab (old id 41371)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:13:21
• date last changed: 2018-11-21 21:09:43