Enzyme-Based Amperometric Biosensors in Flow-Systems for Biomolecule Detection

Abstract

Amperometric enzyme based biosensors were designed, developed and characterised in flow systems. Solid graphite and carbon paste electrodes were used as support for enzyme immobilisation. Both mediated and direct electron transfers between redox enzymes and electrodes were utilised for biosensor construction, as well as coupled enzyme systems. Special emphasis was placed on the optimisation of biosensor characteristics such as detection limit, stability, sensitivity, and selectivity. The effect of various polyelectrolytes on the carbon paste biosensor performance was investigated, resulting in a stabile and sensitive alcohol biosensor. Biosensors were also developed for detection of acetylcholine, carbohydrates, glucose, L-lactic acid, L-glutamate and beta-N-oxalyl-L-alfa, beta-diaminopropionic acid (beta-ODAP).



Biosensors were applied as detectors in integrated flow systems for fast and selective detection. A dual biosensor cell, containing one glucose and one L-lactic acid electrode, was integrated with a microdialysis sampling system, which allowed simultaneous detection and on-line monitoring of a fermentation process. Also, an integrated flow system relying on the selectivity of L-glutamate oxidase for the toxic beta-form of ODAP, was utilised together with liquid chromatography and refractive index (RI) detection, enabling quantification of both total ODAP (alfa and beta-form) and beta-ODAP through the combined use of RI and biosensor detection.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Analytisk kemi innefattar metoder för bestämning av den kemiska sammansättningen hos prover och ämnen. En kvalitativ metod ger information om den atomära eller molekylära sammansättningen medan en kvantitativ metod ger numeriska värden på hur mycket det finns av en eller flera av de komponenter som ingår i ett prov. En kombination av de båda metoderna är ofta önskvärd då man får så mycket information om provet som möjligt, samt att både analystid och pengar kan sparas vid bestämningen.



Graden av selektivitet (förmågan att känna igen ett specifikt ämne) hos en analytisk metod spelar stor roll då man är intresserad av en komponent som befinner sig i ett prov med komplicerad sammansättning. Ju högre selektivitet en metod har, desto mer exakt kan den urskilja ett specifikt ämne av låg koncentration i ett komplicerat prov som t.ex. miljöprover, medicinska prover och prover från livsmedelsindustrin. Genom att upparbeta (förbehandla) proverna och använda en analysmetod som bygger på separation av de ingående komponenterna kan en selektiv analys genomföras, men tyvärr så är detta förfarande ofta tidskrävande. Ett annat (och snabbare) tillvägagångssätt är att utnyttja detektorer (sensorer) som är selektiva för den komponent man är intresserad av. Sådana sensorer (biosensorer) kan vara baserade på biokemiska reaktioner hos biologiska element, t.ex. antikroppar, celler och enzym, som har hög selektivitet för sina naturliga antigener och substrat. Biosensorer omvandlar den biokemiska signalen till en mätbar signal som t.ex. ljus, värme eller ström med hjälp av en signalöverförare.



I denna avhandling har enzymbaserade elektrokemiska biosensorer utvecklats och utvärderats för olika enzym (biologiska element) och signalöverförare (grafit eller kolpastaelektroder). Grundstenen är att välja ett enzym som är selektivt för det ämne (substrat) man vill detektera, varefter enzymet immobiliseras på en elektrod av lämpligt material. Detektionen bygger på att enzymet katalyserar en reaktion som inkluderar överföring (upptagning eller avgivning) av elektroner (en s.k. redoxreaktion). Dessa elektroner kan tas upp eller avges av elektroden vilket resulterar i att en mätbar ström kommer att flyta genom systemet. Denna ström är proportionell mot substrat-koncentrationen i provet, d.v.s. en kvantitativ analys av provet är möjlig. Elektron-överföringen mellan enzym och elektrod är en komplicerad process och i de flesta fall är det inte möjligt för elektronerna att röra sig direkt mellan de båda. I sådana fall så är det fördelaktigt att använda sig av en redoxmediator, d.v.s. en lite artificiell molekyl som hjälper elektrontransporten genom att ta upp eller avge de elektroner som ska förflyttas mellan elektroden och enzymet (s.k. medierad elektronöverföring). Genom att immobilisera mer än ett enzym på biosensorn är det också möjligt att använda "kopplade enzymsystem" där produkten från det första enzymet fungerar som substrat för nästa enzym. Fördelen är bl.a. att man kan utnyttja selektiviteten hos det första enzymet utan att det behöver vara ett enzym med elektronöverföring.



I avhandlingen har biosensorer baserade både på medierad elektronöverföring och "kopplade enzymsystem" använts för detektion av kolhydrater, glukos, etanol o.s.v. Genom att använda två biosensorer samtidigt var det möjligt att följa vad som sker med en fermentationprocess i realtid. I en annan applikation kunde selektiv och kvantitativ bestämning av en giftig aminosyra göras, medan en tredje biosensor har utvecklats för bestämning av nervtransmittern acetylkolin i mikrodialysat från en råtthjärna.

• author: Larsson, Niklas
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Palleschi, Giuseppe, Universita' degli Studi di Roma
• organization: Centre for Analysis and Synthesis
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Analytical Chemistry
• keywords: Microdialysis, Liquid chromatography, Flow injection, Polyelectrolytes, Carbohydrate, Mediator, Dehydrogenase, Peroxidase, Oxidase, Enzyme, Amperometric detection, Carbon paste, Biosensor, Graphite electrode, On-line monitoring, Analytical chemistry, Analytisk kemi
• pages: 150 pages
• defense location: Kemicentrum, Sölvegatan 39, Lund, Hörsal C
• defense date: 2001-04-20 10:15:00
• ISBN: 91-7874-128-9
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Analytical Chemistry (S/LTH) (011001004)
• id: c4af9f47-5431-44e0-b6e7-9c217784d870 (old id 41414)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:23:44
• date last changed: 2018-11-21 21:10:41