Advanced

A kinetic study of metabolite transfer in coupled two-enzyme reactions

Pettersson, Henrik LU (2001)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

I vår kropp står ämnesomsättningen för nedbrytning av mat till kemiska ämnen som är nödvändiga för vår energiförsörjning, kroppsuppbyggnad och fortplantning. Varje cell i varje organism tillverkar eller tar upp små molekyler, som de sedan sätter ihop till stora molekyler. Samtidigt som detta sker så bryter cellerna ner molekyler som har blivit tillverkade. Ur detta får vi ett komplicerat nätverk av metaboliska reaktioner för framställning eller nedbrytning av ämnen som behövs för förnyelse av celler och organ. Reaktionerna som har hand om den viktiga uppgiften att få celler eller multicellulära organismer att reproducera sig själva. De metaboliska reaktioner som medverkar i syntes eller... (More)
Popular Abstract in Swedish

I vår kropp står ämnesomsättningen för nedbrytning av mat till kemiska ämnen som är nödvändiga för vår energiförsörjning, kroppsuppbyggnad och fortplantning. Varje cell i varje organism tillverkar eller tar upp små molekyler, som de sedan sätter ihop till stora molekyler. Samtidigt som detta sker så bryter cellerna ner molekyler som har blivit tillverkade. Ur detta får vi ett komplicerat nätverk av metaboliska reaktioner för framställning eller nedbrytning av ämnen som behövs för förnyelse av celler och organ. Reaktionerna som har hand om den viktiga uppgiften att få celler eller multicellulära organismer att reproducera sig själva. De metaboliska reaktioner som medverkar i syntes eller nedbrytning av specifika ämnen kallas vanligtvis en metabolisk väg.



En central metabolisk väg är den glykolytiska, som omvandlar glukos till pyruvat genom en serie av enzymkatalyserade reaktioner. Glykolysen sker i alla levande celler. Den förser cellen och organismen med energi både under anaeroba (= utan syre) och aeroba (= med syre) förhållanden. Glykolytiska mellanprodukter deltar i en mängd andra metaboliska vägar som har stor betydelse för ämnesomsättningen, bland annat bildande av fett samt i gröna växter koldioxid och kolhydrater. I aeroba organismer omvandlas den glykolytiska produkten pyruvat till acetyl-CoA, en viktig metabolit som går in i citronsyracykeln och därifrån länkas vidare till en mängd olika biosyntetiska processer.



Gemensamt för alla metaboliska vägar är att de innehåller sekvenser av enzymkatalyserade reaktioner. Produkten från ett enzym är substrat till en eller flera på varandra följande reaktioner. Därför måste denna produkt överföras från det producerande enzymet till det konsumerande. Mekanismen bakom en sådan metabolitförflyttning är av avgörande betydelse för hur metaboliska vägar beter sig och regleras.



Det finns två väsentligt olika sätt som en metabolit kan överföras mellan enzymer i metaboliska vägar. Om enzymen inte kan bilda komplex med varandra, måste metaboliten först frigöras från det producerande enzymet och sedan förflyttas till det konsumerande enzymet via reaktionslösningen genom fri diffusion. Om de två sekventiella enzymen är kapabla att bilda komplex med varandra så finns det en alternativ metabolitöverföringsmekanism som kan vara gångbar. Metaboliten kan då överföras direkt mellan det producerande enzymet och det konsumerande, utan att metaboliten frigörs ut i reaktionslösningen. Termen kanalisering har myntats för att referera till en sådan direkt metabolitöverföring. Att fastställa vilken av dessa två överföringsmekanismer som (generellt eller i enskilda fall) förekommer är av stor betydelse för vår förståelse av enzymers samverkan och metaboliska processers beteende och reglering.



Denna avhandling sammanfattar fyra stycken studier som handlar om hypotesen att metaboliter kan kanaliseras i system som kan bilda bienzymkomplex.



Vi har utfört några avgörande kinetiska experiment för att utröna om det finns någon skillnad i överföringsmekanismen av NADH mellan dehydrogenaser beroende av den kirala ko-enzym specificiteten hos enzymen. Vidare undersökte vi den påstådda kanaliseringen av dihydroxyacetonfosfat mellan aldolas och glycerol-3-fosfatdehydrogenas och även de isotoputspädningsdata som påstås svara mot en kanaliserad överföring av glyceraldehyd-3-fosfat mellan aldolas och glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas. I våra undersökningar av de kopplade reaktionerna katalyserade av fusionsproteinen malatdehydrogenase och citratsyntas samt b-galaktosidas och galaktosdehydrogenas använde vi en ny teoretisk modell som bygger på den förväntade fria diffusionsmekanismens uppförande på fusionsproteinet då alla kinetiska egenskaper baseras på fusionsproteinet självt.



Våra resultat ledde till slutsatsen att det inte finns några hållbara bevis för metabolit kanalisering i system som innehåller glykolytiska enzym. Vi fann också att kanalisering genom så kallade närhetseffekter är av försumbar betydelse. (Less)
Abstract
There are two fundamentally different ways by which a metabolite can be transferred between enzymes in metabolic pathways. If the two sequential enzymes cannot form a complex with each other, the metabolite must first be released from the producing enzyme to the reaction medium and then be transported to the consuming enzyme, via the reaction medium, by free diffusion. If the two sequential enzymes are capable of forming a complex with each other, an alternative metabolite transfer mechanism could be operative. The metabolite might then be directly transferred from the producing enzyme to the consuming one without prior release to solution. The term ?channelling? refer to such a mechanism of direct metabolite transfer. The mechanism by... (More)
There are two fundamentally different ways by which a metabolite can be transferred between enzymes in metabolic pathways. If the two sequential enzymes cannot form a complex with each other, the metabolite must first be released from the producing enzyme to the reaction medium and then be transported to the consuming enzyme, via the reaction medium, by free diffusion. If the two sequential enzymes are capable of forming a complex with each other, an alternative metabolite transfer mechanism could be operative. The metabolite might then be directly transferred from the producing enzyme to the consuming one without prior release to solution. The term ?channelling? refer to such a mechanism of direct metabolite transfer. The mechanism by which this metabolite transfer takes place is a main determinant of the kinetic characteristics and control properties of the sequential metabolic enzyme reactions. Establishing what mechanism of metabolite transfer is applicable in specific cases, or in general, is therefore a matter of outstanding importance for our understanding of the behaviour and regulation of metabolic pathways. This thesis deals with the hypothesis concerning metabolite channelling in systems that may form dynamic bi-enzyme complexes in vitro. Some crucial steady-state and transient-state kinetic experiments were carried out, aiming at testing if there is any general difference in the mechanism of NADH transfer between dehydrogenases depending on the chiral coenzyme specificity of the enzymes. The next investigation was initiated to examine the unchallenged proposal of a channelled transfer of dihydroxyacetone phosphate in the reaction system of aldolase and glycerol 3-phosphate dehydrogenase, just as the unchallenged isotope dilution data taken to be indicative of a channelled transfer of glyceraldehyde-3-phosphate in the reaction system of aldolase and glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase. In the final two studies the coupled reactions catalysed by the fusion protein of malate dehydrogenase and citrate synthase, and of beta-galactosidase and galactose dehydrogenase were examined, by using a new and more direct approach where all predictions on the expected free diffusion behaviour of the fusion protein were based upon the kinetic properties of the fusion protein itself. From the results achieved it was concluded that no tenable evidence is available for metabolite channelling in systems involving glycolytic enzymes; and the results obtained also provide clear evidence that channelling due to proximity effects either is absent or of negligible quantitative significance. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
opponent
  • Professor Cornish-Bowden, Athel, CNR, Marseille, France
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
Metabolism, Free diffusion, Enzyme kinetics, Channelling, Dehydrogenase, Fusion protein, Biochemistry, Proximity effect, metabolism, Biokemi
pages
84 pages
publisher
Henrik Pettersson, Department of Biochemistry, Lund University, Centre for Chemistry and Chemical Engineering
defense location
Lecture hall C, Centre for Chemistry and Chemical Engineering, Lund, Sweden
defense date
2001-11-30 15:15
ISBN
91-628-4976-X
language
English
LU publication?
yes
id
a72c5d7a-518e-4d73-9085-95fdfabe4f3c (old id 42110)
date added to LUP
2007-10-14 16:37:01
date last changed
2016-09-19 08:45:02
@misc{a72c5d7a-518e-4d73-9085-95fdfabe4f3c,
  abstract     = {There are two fundamentally different ways by which a metabolite can be transferred between enzymes in metabolic pathways. If the two sequential enzymes cannot form a complex with each other, the metabolite must first be released from the producing enzyme to the reaction medium and then be transported to the consuming enzyme, via the reaction medium, by free diffusion. If the two sequential enzymes are capable of forming a complex with each other, an alternative metabolite transfer mechanism could be operative. The metabolite might then be directly transferred from the producing enzyme to the consuming one without prior release to solution. The term ?channelling? refer to such a mechanism of direct metabolite transfer. The mechanism by which this metabolite transfer takes place is a main determinant of the kinetic characteristics and control properties of the sequential metabolic enzyme reactions. Establishing what mechanism of metabolite transfer is applicable in specific cases, or in general, is therefore a matter of outstanding importance for our understanding of the behaviour and regulation of metabolic pathways. This thesis deals with the hypothesis concerning metabolite channelling in systems that may form dynamic bi-enzyme complexes in vitro. Some crucial steady-state and transient-state kinetic experiments were carried out, aiming at testing if there is any general difference in the mechanism of NADH transfer between dehydrogenases depending on the chiral coenzyme specificity of the enzymes. The next investigation was initiated to examine the unchallenged proposal of a channelled transfer of dihydroxyacetone phosphate in the reaction system of aldolase and glycerol 3-phosphate dehydrogenase, just as the unchallenged isotope dilution data taken to be indicative of a channelled transfer of glyceraldehyde-3-phosphate in the reaction system of aldolase and glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase. In the final two studies the coupled reactions catalysed by the fusion protein of malate dehydrogenase and citrate synthase, and of beta-galactosidase and galactose dehydrogenase were examined, by using a new and more direct approach where all predictions on the expected free diffusion behaviour of the fusion protein were based upon the kinetic properties of the fusion protein itself. From the results achieved it was concluded that no tenable evidence is available for metabolite channelling in systems involving glycolytic enzymes; and the results obtained also provide clear evidence that channelling due to proximity effects either is absent or of negligible quantitative significance.},
  author       = {Pettersson, Henrik},
  isbn         = {91-628-4976-X},
  keyword      = {Metabolism,Free diffusion,Enzyme kinetics,Channelling,Dehydrogenase,Fusion protein,Biochemistry,Proximity effect,metabolism,Biokemi},
  language     = {eng},
  pages        = {84},
  publisher    = {ARRAY(0xa124f58)},
  title        = {A kinetic study of metabolite transfer in coupled two-enzyme reactions},
  year         = {2001},
}