Crystallographic studies on porphyrin metallation by ferrochelatase.

Abstract

Ferrochelatase catalyses the terminal step in heme biosynthesis by inserting a ferrous ion into protoporphyrin IX. The reaction mechanism has in this thesis been studied by mainly crystallographic methods.



The structure of ferrochelatase from Bacillus subtilis co-crystallized with N-methyl mesoporphyrin allowed for the first time a characterization of the active site of the enzyme. The structure suggests a mechanism of porphyrin distortion where the pyrrole rings B, C and D are fixed by the enzyme, while pyrrole ring A is forced to tilt 36?.



Soakings of Zn2+ into ferrochelatase crystals showed that the metal was coordinated to the invariant residues His183 and Glu264 located in the active site. These residues are proposed to participate in a sitting-atop complex with the metal and porphyrin.



A fully hydrated Mg2+ complex was found located 7 Å away from the Zn2+ ion. Mg2+ had a stimulatory effect on the enzyme activity. From biochemical and theoretical studies it was found that the two metals interact with each other, resulting in lower binding affinity for Zn2+.



The structure of ferrochelatase from Saccharomyces cerevisiae was determined to a resolution of 2.4 Å. It was found to be a homodimer. Metal soakings with a substrate metal (Co2+) and an inhibitor (Cd2+) showed that they were bound to the same site as was observed earlier for ferrochelatase from B. subtilis. The observation that the two monomers bind metal differently suggest that porphyrin metallation in the yeast monomers occur in an alternating fashion, like a two-stroke engine.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Proteiner är livsnödvändiga och finns i alla celler. De flesta proteinerna katalysear kemiska reaktioner och kallas då enzymer. Enzymer och proteiner (äggviteämnen) är uppbyggda av aminosyror ihopkopplade till kedjor som kan vara olika långa. Det finns 20 stycken olika aminosyror. Man kan göra en liknelse med ett pärlhalsband tillverkat av 20 olika pärlor, varje pärla med var sin färg. Då blir proteinkedjan ett långt pärlhalsband med färger som kommer efter varandra i en till synes slumpvis ordning. Men ordningen samt längden på kedjan är inte slumpvis i cellerna, den styrs av generna. Generna kan sägas vara cellens arkiv, där enstaka kopior kan hämtas ut på ritningar för hur proteinerna ska vara sammansatta. Kopiorna används av cellens speciella maskiner för proteinproduktion, ribosomerna.



Ordningen av aminosyrorna och längden på kedjan bestämmer hur protein kedjan veckar sig och hur strukturen således kommer att se ut. Om strukturen är känd kan man få viktiga ledtrådar för att kunna designa läkemedel rätt. Man kan visserligen ta reda på vad ett visst enzym gör och när det gör det, men inte hur enzymet katalyserar en reaktion, om inte dess struktur är känd.



Röntgenkristallografi och proteinkristaller Strukturbestämning kan göras antingen med NMR-teknik (Nuclear magnetic resonance) eller med röntgenkristallografi, som jag har använt mig av. Metoden bygger på att man låter växa kristaller av proteinet man vill strukturbestämma. En kristall är sammansatt av miljarder av molekyler som sitter i ett regelbundet tredimensionellt mönster, på samma vis som natrium och kloridjonerna bygger upp vanligt koksalt.



Proteinkristaller kan man få att bildas när man låter sin koncentrerade proteinlösning under vissa kemiska betingelser långsamt torka, fastän inte torka ut helt. Det kan ibland ta tid att hitta de speciella kemiska betingelserna, eftersom olika protein kräver olika betingelser för att kristallisera. Med lite tur och skicklighet kan man få fram kristaller stora nog för att man ska kunna undersöka dem och exponera dem för en stark och koncentrerad röntgenstråle. I kristallografin utnyttjar man ett fenomen som kallas diffraktion. Fenomenet medför att röntgenstrålar som passerar en proteinkristall sprids åt olika håll, som om det fanns osynliga små spegelplan som reflekterade röntgenstrålarna i kristallen. Mönstret av de spridda röntgenstrålarna som uppkommer efter att ha gått igenom kristallen tas tillvara. De erhållna mätdata databehandlas med hjälp av matematiska modeller som beskriver hur kristaller geometriskt är uppbyggda. Eftersom det är elektronerna från alla atomer i kristallen som tillsammans sprider röntgenstrålarna är det i slutändan ett tredimensionellt elektronmoln man får ut efter strukturbestämningen. Med ett tydligt tredimensionellt elektronmoln kan man passa in proteinet bit för bit, aminosyra för aminosyra. På så vis får man fram, förenklat beskrivet, en modell för proteinstrukturen.



Ferrochelatase tillverkar heme Jag har studerat enzymet som katalyserar reaktionen då en järn-atom sätts på plats i en liten molekyl som kallas protoporfyrin så att heme bildas. Det är samma heme som behövs för kroppens produktion av hemoglobin. Enzymet som utför denna reaktion heter ferrochelatase. En defekt i genen för ferrochelatas leder till en blodsjukdom med symptom som ljuskänslig hy och leverskador. Hemoglobin finns i de röda blodkropparna i blodet och har till uppgift att transportera syre till alla kroppens celler. En vuxen man har 200 miljarder röda blodkroppar. De har en livslängd på ca 120 dagar, och varje minut behövs därför över 1 miljon nya röda blodkroppar produceras. Denna enorma produktion sker med hjälp av enzymet ferrochelatas.



Reaktionsmekanismen börjar klarna Med ledning av strukturella data av enzymet tillsammans med olika metaller (tex koppar, cobolt, cadmium och zink) och en hemeliknande molekyl, har jag studerat hur och var de båda substraten binder in till proteinet. På så sätt har man kunnat skapa en bild av de olika stegen i reaktionsmekanismen.



Det visade sig att enzymet fungerar som en magnet och "drar in" järn-atomen till det aktiva sätet i enzymet där reaktionen äger rum. Den blivande hememolekylen böjs dessutom så att järnatomen lättare kan "hoppa in". När järnet sitter på plats lossnar heme för att det inte längre passar så bra in i enzymets bindningsficka. Då blir det plats för en ny reaktioncykel och så håller det på. Hemet transporteras vidare av kroppens transportmaskineri och sätts ihop med ett protein så att hemoglobin bildas till nytta för syretransporten.



Dessa rön om hur en metall sätts in med hjälp av enzym kan ge viktiga ledtrådar för hur andra liknande molekyler som innehåller metall bildas, tex klorofyll i växter, (då magnesium sätts in) och vitamin B12 (då cobolt sätts in).

• author: Lecerof, David
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Andersson, Inger, Dept of Molecular Biology, Uppsala Univ
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2002
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: thermal and mechanical properties, Condensed matter:stucture, fasjämvikt, kristallografi, egenskaper (termiska och mekaniska), Kondenserade materiens egenskaper:struktur, crystallography, phase equilibria, Magnesium, pi-helix, Zinc, ferrochelatase, Metal binding, porphyrin metallation
• pages: 124 pages
• defense location: Centre for Chemistry and Chemical Engineering, Lund Univ
• defense date: 2002-05-30 13:15:00
• ISBN: 91-628-5268-X
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 05fa989d-7afd-41f0-95c2-24c39f9f336f (old id 464683)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:12:57
• date last changed: 2018-11-21 21:09:41