In vivo properties of neural stem cells after transplantation into the rat brain-Studies of phenotypic differentiation and functional integration using cell-specific labelling and electrophysiological techniques

Abstract

In the present thesis, we have examined the in vivo properties of in vitro expanded human and rat neural stem-and progenitor cells after transplantation into the neonatal and adult rat brain. The survival and differentiation of the grafted cells were assessed using species-specific antisera, and pre-labelling with the reporter gene green fluorescent protein (GFP). Long-term growth factor-expanded human progenitors successfully survived after grafting into the neonatal and adult striatum, subventricular zone (SVZ) and hippocampus. Target-directed migration, and region-specific neuronal differentiation of grafted cells were observed after transplantation into the neurogenic SVZ and hippocampus. Extensive migration of implanted cells identified as glial progenitors, occured within white matter. In the striatum and hippocampus, neuronal and glial differentiation were most pronounced at the graft core, with both neuronal and glial processes extending over long distances. A fraction of non-migratory undifferentiated cells remained at the implantation site. Neurogenic properties of the neural cell line RN33B, carrying the GFP reporter gene, were studied after grafting to the neonatal brain. Large numbers of RN33B cells differentiated into pyramidal neurons in the cortex and hippocampus, with projections to normal target regions, such as the thalamus and contralateral hippocampus, respectively, as revealed by retrograde tracing. Whole-cell patch clamp recordings of grafted cortical pyramidal neurons showed that RN33B cells develop physiological properties of mature neurons and become functionally integrated within host neural circuitry. Our data demonstrate a remarkable capacity of expandable neural precursors for different types of migration, and multipotential differentiation, along neuronal and glial lineages. Along with region-specific neuronal differentiation we observed establishment of appropriate anatomical projections, and functional integration into host circuitry. These results suggest that these cell types are highly useful for further research into the mechanisms responsible for cellular migration, differentiation and integration in the mature central nervous system.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Forskning om stamceller har fått mycket uppmärksamhet de senaste åren. Mycket av intresset avspeglar möjligheten att använda denna typ av celler som en terapi för att bota olika sjukdomar. En stam cell från hjärnan är en cell som har förmåga att dela sig symmetriskt, varvid två kopior bildas eller asymmetriskt, vilket ger upphov till en ny stam cell samt en progenitorcell. En progenitorcell har ett förutbestämt öde, att utvecklas till en nervcell eller en stödjecell (gliacell), samt förmågan att dela sig under en kortare period. Stamceller som har isolerats från den embryonala och vuxna hjärnan, kan odlas i cellkultur under specifika betingelser. Egenskaperna hos de isolerade stam- och progenitorcellerna för nerv- och gliaceller (tillsammans kallade neurala celler) har studerats främst i cellodling (in vitro) och efter transplantation (in vivo), och resultaten har varit betydelsefulla för kartläggandet av neurobiologiska förlopp under utvecklingen. Då neurala stam-och progenitor celler kan mångfaldigas och modifieras i cellodling betraktas de också som en möjlig celltyp för framtida klinisk tillämpning med celltransplantation, till exempel för patienter med Parkinsons sjukdom. En eventuell användning av stamceller i denna typ av applikation kräver grundläggande experimentella försök för att dokumentera cellernas egenskaper och framförallt förmåga att funktionellt integrera med värdhjärnan efter transplantation.



Mitt avhandlingsarbete handlar om karakterisering av sådana embryonala neurala stam- och progenitor celler efter transplantation till hjärnan på råtta. Ett antal olika metoder användes för att detektera cellerna efter implantationen, bland annat reporter genen Green Fluorescent Protein (GFP). I det första delarbetet optimerades metoden för inmärkning av neurala celler med reporter genen, och då primärt i syfte att uttryckas efter transplantation. Då GFP är distribuerad i hela cytoplasman, visualiseras hela morfologin av cellerna. I de två följande delarbetena beskrivs hur humana neurala cell linjer etablerade från embryonal vävnad, kan odlas som så kallade neurosfärer och expanderas upp till ett år i närvaro av mitogena tillväxtfaktorer, med bibehållen förmåga att mogna till nerv- och gliaceller. Dessa cell linjer överlever väl upp till över ett år efter transplantation till hjärnan på nyfödda och vuxna råttor. Cellerna analyserades in vivo med human-specifika generella och phenotypiska markörer, samt med hjälp av reporter genen GFP. Efter transplantation till de neurogena områden, d v s den subventrikulära zonen och hippocampus, migrerar de humana cellerna och differentierar till region-specifika neuron likt värdhjärnans nervcells-progenitorer. Efter implantation i det icke-neurogena striatum migrerar cellerna, identifierade som gliaprogenitorer, över långa distanser i vit vävnad. I striatum utvecklades en signifikant del av de transplanterade cellerna till nervceller, med projicerar till korrekta målområden. En del av de transplanterade humana cellerna mognade till astrocyter och oligodendrocyter, vilket innebär att de humana celllinjerna är multipotenta även in vivo. GFP-positiva nervceller hade morfologiska egenskaper som är karakteristiska för mogna nervceller, såsom rikt förgrenade dendriter med spines. Trots kapacitet att migrera och differentiera till nerv och- gliaceller efter transplantation, kvarstår frågan till vilken grad de humana progenitorerna kan integrera funktionellt med värdhjärnan.



I de två sista delarbetena studerades den immortaliserade neurala cellinjen RN33B, som är genererad från embryonala hjärnstamsceller i råtta. Den temperaturkänsliga immortaliseringsgenen gör att cellerna delar sig vid 33°C i cell odling, men vid 37°C mognar cellerna och då främst till nervceller in vitro. RN33B- cellerna märktes med reporter genen GFP (se ovan) in vitro, och sedan studerades cellernas kapacitet att utvecklas till regionspecifika nervceller samt att integrera funktionellt med värdhjärnan studerades morfologiskt efter transplantation till hjärnan på nyfödda råttor. RN33B cellerna överlevde väl upp till 4 månader efter transplantationen och bildade både nervceller och gliaceller. Vidare visade den morfologiska analysen att RN33B-cellerna har en exceptionell förmåga att bilda pyramidala nervceller i cortex och hippocampus, med projektioner till korrekta målområden. Projektionerna studerades genom injektioner av Fluorogold (FG), som transporteras från projektionerna i målområdet till cellkroppen. Slutligen visade vi, med hjälp av så kallad patch-clamp teknik, att transplanterade GFP-positiva RN33B pyramidceller i cortex har normala elektrofysiologiska egenskaper samt tar emot information från omkringliggande celler i värdhjärnan. Sammanfattningsvis visar studierna i denna avhandling att neurala stamceller överlever transplantation, och utmognar till nerv- och gliaceller. Vidare så utvecklade nervcellerna projektioner som nådde till korrekta målområden, samt integrerade funktionellt med värdhjärnan. Dessa egenskaper i kombination med möjligheten att mångfaldiga de neurala celltyperna in vitro är mycket intressanta för fortsatta studier rörande funktionell integration efter transplantation och utveckling av celler för transplantation i djurmodeller av neurodegenerativa sjukdomar.

• author: Englund Johansson, Ulrica
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Eriksson, Peter
• organization: Ophthalmology, Lund
• publishing date: 2002
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Neurosciences
• keywords: cell line, Neurology, neuropsychology, neurophysiology, Neurologi, neuropsykologi, neurofysiologi, functional integration, electrophysiology, retrograde tracing, immortalized, GFP, migration, axonal projections, glia, neuron, transplantation, stem cell. progenitor cell, CNS
• pages: 184 pages
• defense location: Segerfalk lecture hall, Wallenberg Neuroscience Center
• defense date: 2002-06-08 10:15:00
• ISBN: 91-628-5213-2
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. U. Englund, C. Ericson, C. Rosenblad, R. J. Mandel, D. Trono, K. Wictorin and C. Lundberg (2000). The use of a recombinant lentiviral vector for ex vivo gene transfer into the rat CNS. NeuroReport11; 3973-3977. Article: II. U. Englund, R. A. Fricker-Gates, C. Lundberg, A. Björklund and K. Wictorin (2002). Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections. Exp. Neurol. 173 (1); 1-21. Article: III. U. Englund, A. Björklund and K. Wictorin (2002). Migration patterns and phenotypic differentiation of long-term expanded human neural progenitor cells after transplantation into the adult rat brain. Dev. Brain Res. 134; 123-141. Article: IV. C. Lundberg, U. Englund, D. Trono, A. Björklund and K. Wictorin (2002). Differentiation of the RN33B cell line into forebrain projection neurons after transplantation into the neonatal rat brain. Exp. Neurol., in press. Article: V. U. Englund, A. Björklund, K. Wictorin, O. Lindvall and M. Kokaia (2002). Grafted neural stem cells develop into functional pyramidal neurons and integrate into host cortical circuitry. Submitted.
• id: d0d97b99-f1fe-464d-ac68-ba169ef4ce43 (old id 464767)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:20:23
• date last changed: 2018-11-21 20:58:11