Advanced

Peptide-tagged proteins in aqueous two-phase systems

Nilsson, Anna LU (2002)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

När en dressing tillreds används ofta olja, vinäger och kryddor. Även om dressingen skakas ordentligt kommer den efter ett tag att dela upp sig i två lösningar, en med olja och en med vinäger. Ett tvåfassystem har bildats där kryddorna fördelar sig mellan olje- och vinägerfasen. Inom biokemiforskning används tvåfassystem av vatten och polymerer. Polymerer är stora molekyler som består av mängder av små enheter, som är sammankopplade till långa kedjor. Genom att blanda två olika sorters polymerer med vatten, kan vattnet på liknande sätt som oljan och vinägern i dressingen dela upp sig i två faser. Polymererna löser sig i vattnet, men lösningen separerar i två faser med i stort sett bara en typ av... (More)
Popular Abstract in Swedish

När en dressing tillreds används ofta olja, vinäger och kryddor. Även om dressingen skakas ordentligt kommer den efter ett tag att dela upp sig i två lösningar, en med olja och en med vinäger. Ett tvåfassystem har bildats där kryddorna fördelar sig mellan olje- och vinägerfasen. Inom biokemiforskning används tvåfassystem av vatten och polymerer. Polymerer är stora molekyler som består av mängder av små enheter, som är sammankopplade till långa kedjor. Genom att blanda två olika sorters polymerer med vatten, kan vattnet på liknande sätt som oljan och vinägern i dressingen dela upp sig i två faser. Polymererna löser sig i vattnet, men lösningen separerar i två faser med i stort sett bara en typ av polymer i varje fas. På motsvarande sätt som kryddorna i dressingen fördelas mellan vinägern och oljan, kan biologiskt material fördelas mellan vattenfaserna.



Ett stort problem inom biokemiforskning är att isolera biomolekyler (t. ex. proteiner, celler eller DNA) på ett milt och effektivt sätt. Ofta krävs en kombination av flera metoder i många olika uppreningssteg. En metod som kan minska antalet steg i ett tidigt skede är separationstekniken vattenbaserade tvåfassystem. Tvåfasseparering går snabbt att utföra och det behövs ingen avancerad utrustning. Vidare är tvåfasseparering relativt enkelt att skala upp från laboratorie- till industriell skala. Ett sätt att förbättra fördelningen av ett protein till en viss fas i ett tvåfasssystem är att sätta på en fusionspartner, exempelvis en peptid, på proteinet med genteknik. En peptid är en kedja av aminosyror (byggstenar i proteiner). Beroende på aminosyrainnehållet i peptiden kan fördelningen av fusionsproteinet riktas mot önskad fas. Den här avhandlingen handlar om sådana fusionsproteiner.



En del av polymererna som använts i detta avhandlingsarbete är termoseparerande. Med termoseparerande menas att polymererna blir mindre lösliga i vatten då temperaturen höjs. Ovanför en viss temperatur, grumlingspunkten, kommer en vattenlösning av polymeren att separera i en vattenfas och en koncentrerad polymerfas. Eftersom proteiner då fördelar sig till vattenfasen kan polymeren återvinnas. I artikel I undersöktes hur aminosyrasammansättningen hos peptiden i fusionsproteinet påverkade fördelningen av proteinet i vattenbaserade tvåfassystem. Den aminosyra som fördelade sig starkast till fasen med termoseparerande polymer var tryptofan. Peptider som innehöll tryptofan användes därför i fusionsproteinerna i artikel I-IV. Om längden av peptiden ökades fördelade sig proteinet starkare till fasen med termoseparerande polymer.



I artikel II och III studerades bland annat effekten av en länk av aminosyror mellan proteinet och peptiden i fusionsproteinet. Länken fick fusionsproteinet att fördela sig bättre mot fasen med termoseparerande polymer. För att förutsäga fusionsproteinets fördelning i tvåfassystemet jämfördes proteinfördelningsdata med hur fria peptider fördelade sig. Full effekt av peptiden erhölls inte i fusionsproteinet. Då detergent (tvålämne) tillsattes i tvåfassystemet blev fördelningen mot den önskade polymerfasen starkare och fusionsproteinet fördelade sig nästan som förväntat från peptidfördelningarna (artikel II). I artikel III användes en hydrofobt (vattenskyende) modifierad termoseparerande polymer. Polymeren termoseparerade vid lägre temperatur än rumstemperatur. Polymeren bildade en mindre koncentrerad polymerfas efter termoseparering än ickemodifierade polymerer och kunde därför ensam användas för tvåfasfördelning av proteiner, d.v.s. ett enpolymersystem.



Med hjälp av fluorescensstudier undersöktes i artikel IV peptidens exponering dels på fusionsproteinytan och dels mot polymerer och detergenter som används i tvåfassystem. Fusionsproteinerna fluorescerade på liknande sätt som de fria peptiderna, vilket tyder på att peptiderna i fusionsproteinerna var exponerade. Vidare ändrades emissionsmaxima för både fusionsproteiner och fria peptider då polymer respektive detergent var närvarande, vilket tyder på en växelverkan mellan peptiden och faskomponenterna.



I artikel V undersöktes fusionsproteiner med peptider som innehöll aminosyran tyrosin. Tyrosinpeptider kan fungera som ett alternativ till tryptofanpeptider, eftersom fusionsproteiner med tryptofanpeptider i en del studier varit svåra att uttrycka vid odling av värdorganismen. Fria tyrosinpeptider fördelade sig något mindre än fria tryptofanpeptider mot en fas som innehöll termoseparerande polymer, men tyrosinpeptider påverkade fördelningen av fusionsproteinet på motsvarande sätt som tryptofanpeptider. (Less)
Abstract
This thesis deals with proteins containing peptide tags for improved partitioning in aqueous two-phase systems. Qualitatively the peptide-tagged protein partitioning could be predicted from peptide data, i.e. partitioning trends found for peptides were also found for the peptide-tagged proteins. However, full effect of the tag as expected from peptide partitioning was not found in the tagged protein. When alkyl-ethylene oxide surfactant was included in a two-polymer system, almost full effect of the tag was obtained. This indicates an improved exposure of the tag to the phase components in the surfactant-containing systems. The most efficient amino acid residue for partitioning towards a phase rich in random copolymer of ethylene oxide and... (More)
This thesis deals with proteins containing peptide tags for improved partitioning in aqueous two-phase systems. Qualitatively the peptide-tagged protein partitioning could be predicted from peptide data, i.e. partitioning trends found for peptides were also found for the peptide-tagged proteins. However, full effect of the tag as expected from peptide partitioning was not found in the tagged protein. When alkyl-ethylene oxide surfactant was included in a two-polymer system, almost full effect of the tag was obtained. This indicates an improved exposure of the tag to the phase components in the surfactant-containing systems. The most efficient amino acid residue for partitioning towards a phase rich in random copolymer of ethylene oxide and propylene oxide (EOPO) was tryptophan. The second most efficient amino acids were tyrosine and phenylalanine. The tag efficiencies were higher for proteins with tyrosine/proline tags compared to proteins with tryptophan/proline tags. The reason can be that the tyrosine residues are more exposed to the solution and phase-forming components, since tyrosine is more hydrophilic than tryptophan.



The partitioning coefficient of cutinase wild-type was calculated from peptide partitioning data combined with surface studies with the computer program GRASP. The calculated partitioning coefficient agreed relatively well with the experimentally determined partition coefficient. Thus, it is possible to obtain an approximate partitioning coefficient of a protein before starting a purification procedure and thereby save time in finding an optimal partitioning system.



The fluorescence emission maximum wavelength for free peptide was longer than for peptide tag in tryptophan-tagged cutinase, indicating larger exposure of free peptides. However, all maxima were obtained at wavelengths corresponding to a polar environment and thus indicating solvent exposure of the tryptophan residues in both free peptides and tags. The emission maximum of the tryptophan tag was moved to longer wavelength when a spacer was introduced between protein and tag. This correlates with results obtained in aqueous two-phase partitioning where a spacer between tag and protein resulted in increased partitioning towards an EOPO copolymer phase. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
opponent
  • Prof Van Alstine, James, Amersham Biosciences, Uppsala
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
Metabolism, Biokemi, metabolism, Biochemistry, green fluorescent protein, cutinase, tryptophan, Aqueous two-phase system, peptide-tagged protein
pages
142 pages
publisher
Prof. Folke Tjerneld, Dept. Biochemistry, Lund University
defense location
Lecture Hall B, Chemical Centre
defense date
2002-10-25 10:15
external identifiers
  • Scopus:0037121457
ISBN
91-7422-009-8
language
English
LU publication?
yes
id
737cc234-05a4-4671-9e8a-fea8f935542c (old id 464965)
date added to LUP
2007-10-14 15:43:55
date last changed
2016-10-13 04:37:13
@misc{737cc234-05a4-4671-9e8a-fea8f935542c,
  abstract     = {This thesis deals with proteins containing peptide tags for improved partitioning in aqueous two-phase systems. Qualitatively the peptide-tagged protein partitioning could be predicted from peptide data, i.e. partitioning trends found for peptides were also found for the peptide-tagged proteins. However, full effect of the tag as expected from peptide partitioning was not found in the tagged protein. When alkyl-ethylene oxide surfactant was included in a two-polymer system, almost full effect of the tag was obtained. This indicates an improved exposure of the tag to the phase components in the surfactant-containing systems. The most efficient amino acid residue for partitioning towards a phase rich in random copolymer of ethylene oxide and propylene oxide (EOPO) was tryptophan. The second most efficient amino acids were tyrosine and phenylalanine. The tag efficiencies were higher for proteins with tyrosine/proline tags compared to proteins with tryptophan/proline tags. The reason can be that the tyrosine residues are more exposed to the solution and phase-forming components, since tyrosine is more hydrophilic than tryptophan.<br/><br>
<br/><br>
The partitioning coefficient of cutinase wild-type was calculated from peptide partitioning data combined with surface studies with the computer program GRASP. The calculated partitioning coefficient agreed relatively well with the experimentally determined partition coefficient. Thus, it is possible to obtain an approximate partitioning coefficient of a protein before starting a purification procedure and thereby save time in finding an optimal partitioning system.<br/><br>
<br/><br>
The fluorescence emission maximum wavelength for free peptide was longer than for peptide tag in tryptophan-tagged cutinase, indicating larger exposure of free peptides. However, all maxima were obtained at wavelengths corresponding to a polar environment and thus indicating solvent exposure of the tryptophan residues in both free peptides and tags. The emission maximum of the tryptophan tag was moved to longer wavelength when a spacer was introduced between protein and tag. This correlates with results obtained in aqueous two-phase partitioning where a spacer between tag and protein resulted in increased partitioning towards an EOPO copolymer phase.},
  author       = {Nilsson, Anna},
  isbn         = {91-7422-009-8},
  keyword      = {Metabolism,Biokemi,metabolism,Biochemistry,green fluorescent protein,cutinase,tryptophan,Aqueous two-phase system,peptide-tagged protein},
  language     = {eng},
  pages        = {142},
  publisher    = {ARRAY(0xa6fc430)},
  title        = {Peptide-tagged proteins in aqueous two-phase systems},
  year         = {2002},
}