Development and Characterization of a Global Brain Ischemia Model in the Mouse -A Genetic and Pharmacological Approach

Abstract

Brain ischemia is a major cause of death and morbidity in the industrialized countries. It is mainly caused by stroke, but may also be the consequence of successful cardiopulmonary resuscitation in victims of cardiac arrest, known as transient global ischemia. Although extensive effort in the field of brain research using experimental rodent models, no neuroprotective treatments are at present available. Advances in gene technology, to manipulate the mouse genome by deleting or overexpressing genes has opened new possibilities to reveal novel pathways in the pathophysiology of ischemic brain damage. The elucidation of the selective neuronal damage following global ischemia, using this genetic approach, has been hampered due to the lack of reproducible models in the mouse.



The first aim of this thesis was to develop a global brain ischemia model in the mouse. Twelve minutes of ischemia was induced by bilateral common carotid artery occlusion under halothane anesthesia and artificial ventilation controlled by online measurement of exhaled CO2. Body and head temperature was rigorously controlled. Bilateral monitoring of cerebral blood flow by laser Doppler during the experiment was crucial to only include hemispheres with a sufficient dense ischemia. Extensive damage was found in the striatum and marked cell damage was observed in hippocampal CA1 and CA2 and thalamus, whereas the CA3 region, dentate gyrus and cortex suffered less damage. Also, hippocampal CA1 injury developed in a delayed manner.



The second aim was to test the applicability of this model in earlier established views on the mechanisms of ischemic cell death. The robust protective effect of intraischemic hypothermia of 33?C was confirmed, and NMDA receptor blockade could if applied directly following ischemia provide protection. Also the endogenous protective effect of adenosine through the adenosine A1 receptor was enlightened by the aggravated effect of blockade of the A1 receptor. However, and possibly even more interesting was the result that did not support and in fact contradicted general views and also some findings in other animals species. Deletion of the gene coding for the adenosine A1 receptor did not aggravate ischemia-induced damage, contrary to pharmacological inhibition of the receptor, indicating that other compensatory neuroprotective mechanism has been activated due to the gene deletion. The notion of a neuroprotective effect of the stress protein heat shock protein 70 (Hsp70) could not be verified in our murine model of global ischemia were Hsp70 was genetically overexpressed. Using a mouse strain deficient in the protease inhibitor cystatin C, we found that the cell death following global and focal ischemia appears to develop differently, or perhaps more correctly stated, different mechanisms are more or less important. The absence of cystatin C aggravated focal ischemic damage while diminishing to the selective neuronal damage induced by global ischemia.



In conclusion, this thesis describes a reliable model of global brain ischemia in the mouse and its applicability to different genetically modified mouse strains show that compensatory mechanisms can be induced in knockout animals and that different mechanisms are involved in focal compared with global ischemic brain damage.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Hjärnskador som uppstår till följd av otillräckligt blodflöde (ischemi) drabbar årligen ett stort antal människor i Sverige och leder antingen till död eller invaliditet och åsamkar stort lidande för den drabbade och dennes anhöriga. Den vanligaste orsaken till hjärnischemi är stroke (slaganfall), som beror på en propp i ett blodkärl eller en hjärnblödning, till en begränsad del av hjärnan. Denna typ av skada kan efterliknas i experimentella djurförsök genom att stänga av ett blodkärl till hjärnan (fokal ischemi). Om inte tillförseln av syre och glukos kommer igång inom en viss tid riskerar den drabbade hjärnvävnaden att förstöras. Nervceller är extremt känsliga för brist på syre och glukos, som bland annat beror på deras höga metabolism och knappa energireserver, vilket gör dem speciellt känsliga för brist på blodtillförsel. En annan typ av hjärnskada är den som uppkommer efter en kortare tids övergående ischemi till hela hjärnan som tex vid hjärtstillestånd (global ischemi). Denna typ av skada drabbar speciella områden i hjärnan som är extra känsliga, tex hippokampus där det tar flera dagar för skadan att utvecklas. Den här försenade nervcellsdöden är intressant och klinskt relevant eftersom det ger möjlighet att terapeutiskt behandla och rädda nervcellerna innan de dör. Skador i hippokampus kan få svåra följder då denna struktur är viktig för inlärning och minne.



Trots omfattande forskning, där djurmodeller framgångsrikt använts för att utröna skademekanismer efter hjärnischemi, finns för närvarande inget nervskyddande läkemedel till patienter med ischemisk hjärnskada. Flera substanser, som visat sig effektiva i djurmodeller, har inte fungerat på människa i kliniska prövningar. Anledningen till denna uteblivna effekt kan vara att viktiga skademekanismer inte upptäckts. Nervcellsdöden efter upphävt blodflöde har visat sig förorsakas av inbyggda mekanismer i cellerna, sk genetiska program, som reglerar celldöden (apoptos). Endogena skyddsmekanismer aktiveras även för att skydda nervcellerna. I möss har gentekniken gjort det möjligt att slå ut enskilda gener eller förstärka deras uttryck, så att mer av genens protein produceras. Detta har gett nya möjligheter att studera vilka inbyggda mekanismer i cellerna som är viktiga för nervcellsdöden. Möjligheten att använda genmodifierade möss för att utröna den selektiva skadan efter upphävt blodflöde till hela hjärnan har varit begränsad. Anledningen är att inga reproducerbara modeller för global hjärnischemi på mus har varit tillgängliga på grund av mössens extrema känslighet, som resulterat i att djuren antingen dött eller inte fått någon reproducerbar skada.



Syftet med den här avhandlingen var att sätta upp en global hjärnischemimodell för möss och karaktärisera denna med redan kända mekanismer och att försöka kartlägga nya viktiga skadevägar i den ischemiska celldöden.



I det första delarbetet beskrivs utformningen av modellen, som använts för att studera global hjärnischemi i mus. I modellen användes 12 minuters avstängning av de båda halsartärerna under halothananestesi och respiration med ventilator, där andningen kontrollerades med direktmätning av koldioxiden i utandningssluften. Hjärntemperatur och kroppstemperatur kontrollerades under experimentet och en uppvärmd kuvös användes det första dygnet för att få reproducerbara skador och låg mortalitet. Även monitorering av blodflödet i hjärnbarken på båda hjärnhalvorna med hjälp av laser Doppler var viktigt för att kunna se om respektive hjärnhalva hade fått tillräckligt lågt blodflöde (<10% av normalt blodflöde) vid avstängning. De hjärnhalvor med blodflöde under 10% uppvisade skador i olika hjärnregioner, däribland hippokampus, vilket också korrelerade med avsaknad av ett blodkärl som försörjer respektive hjärnhemisfär med blod från artärerna i nackkotpelaren.



Låg kroppstemperatur (hypotermi) under ischemi är känd som den mest skyddande behandlingen för att minska nervcellsskada och gav även i denna modell, då kroppstemperaturen sänktes till 33?C, ett robust skydd.



Den ischemiska skadeprocessen börjar med inflöde av kalcium till nervcellerna och leder till celldöd om ischemin får fortgå. Transmittorsubstansen glutamat frisätts under hjärnischemi och aktiverar NMDA-receptorn, vilket ökar kalciuminflödet. En substans som blockerar denna receptor användes, vilket också visade sig lindra hjärnskadorna efter ischemi i vår musmodell om denna drog gavs direkt efter försöket.



Proteinstress anses vara en betydande komponent i den ischemiska celldöden, vilket leder till att proteiners funktion inte kan upprätthållas. I det andra delarbetet undersöktes ett protein, heat shock protein 70 (Hsp70), som uttrycktes efter ischemi och som har till uppgift att skydda proteiner mot stress. Eftersom Hsp70 har föreslagits vara skyddande för nervceller användes en musstam som överuttryckte Hsp70 och proteinet fanns således tillgängligt i stora mängder även under ischemiförsöket. Vid försöken konstaterades inget ytterligare skydd i dessa Hsp70 överuttryckande djur jämfört med normala möss. Resultaten antyder att Hsp70 inte har någon avgörande roll för nervcellsskydd efter global hjärnischemi.



Adenosin är en inhibitorisk neuromodulator i hjärnan, där adenosin bla signalerar via adenosine A1-receptorn. Aktivering av denna receptor minskar signaleringen mellan nervceller och därmed frisättningen av glutamat och det farliga kalciuminflödet till nervcellerna. Vid hjärnischemi ökar koncentrationen av adenosin och anses minska ischemisk hjärnskadan, vilket vi studerade i det tredje delarbetet. Den skyddande effekten av adenosin i hjärnan under ischemi genom dess signalering via A1-receptorn bekräftades i försök där farmakologisk inhibition av receptorn ökade skadan efter global hjärnischemi. Däremot, och möjligen ännu mer intressant, sågs ingen skillnad i skada hos möss med genetiskt utslagen A1-receptor, vilket även bekräftades i en ischemisk in vitro modell med vävnadskulturer av hippokampus. Dessa fynd tyder på att andra kompensatoriska mekanismer har aktiverats i möss med utslagen A1-receptor. Identifiering av dessa kompensatoriska mekanismer kan ge ledtrådar om skyddande komponenter efter ischemisk hjärnskada.



Det stora inflödet av kalcium under ischemin aktiverar proteaser, som bryter ner olika proteiner, såsom enzym och strukturproteiner, i och utanför cellen. Endogena inhibitorer till dessa proteaser är viktiga för att upprätthålla balans i nedbrytning av proteiner. Cystatin C är en sådan proteasinhibitor som inhiberar lysosomala enzymer, vilka tros läcka ut under ischemin. Därmed torde närvaron av cystatin C vara skyddande, vilket vi ville studera i det fjärde delarbetet. Cystatin C har även immunomudulatorisk funktion och är dessutom lokaliserat till proteinaggregat i Alzheimer´s sjukdom, vilket tyder på flera olika funktioner för cystatin C. Möss med en utslagen gen för cystatin C undersöktes. Vid ischemisk stroke, fokal ischemia, konstaterades att infarkten var större hos möss med avsaknad av cystatin C, orsaken härtill torde vara aktivering av proteaser. I motsats till vår hypotes visade sig skadebilden vara den omvända efter global ischemi, där de möss som inte hade något cystatin C var mindre skadade. Detta indikerar att olika skademekanimer i de båda hjärnischemimodellerna är mer eller mindre betydelsefulla.



Denna avhandling beskriver sålunda en pålitlig modell av global hjärnsichemi i mus och dess användbarhet i olika genmodifierade musstammar. Den visar att kompensatoriska mekanismer kan induceras i genmodifierade möss, hos vilka en gen slagits ut. Avhandlingen visar även att olika skademekanismer är involverade efter global och fokal ischemisk hjärnskada.

• author: Olsson, Tomas
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Blomgren, Klas, Göteborgs Universitet
• organization: Neuroinflammation (research group)
• publishing date: 2004
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Other Clinical Medicine
• keywords: neurofysiologi, neuropsykologi, Neurologi, neuropsychology, Neurology, global, hypothermia, hsp70, receptor, adenosine A1, NMDA, cystatin C, cell death, hippocampus, Brain, ischemia, neurophysiology
• pages: 143 pages
• defense location: Segerfalksalen, WNC, Lund University
• defense date: 2004-02-28 10:15:00
• ISBN: 91-628-5946-3
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Olsson T, Wieloch T, Smith ML. Brain damage in a mouse model of global cerebral ischemia. Effect of NMDA receptor blockade. Brain Res. 2003 Aug 29; 982(2): 260-9. Article: II. Olsson T, Hansson O, Nylandsted J, Jaattela M, Smith ML, Wieloch T.Lack of neuroprotection by heat shock protein 70 overexpression in a mouse model of global cerebral ischemia. Exp Brain Res. 2004 Feb 154 (2): 442-449 (published online: 25 Oct 2003) Article: III. Olsson T, Nygren J, Håkansson K, Lundblad C, Grubb A, Smith ML, Wieloch T. Gene deletion of cystatin C aggravates brain damage following focal ischemia but mitigates the neuronal injury after global ischemia in the mouse. Submitted. Article: IV. Olsson T, Cronberg T, Rytter A, Asztély F, Fredholm B, Smith ML, Wieloch T. Deletion of the adenosine A1 receptor gene does not alter neuronal damage following ischemia in vivo or in vitro. Submitted.
• id: d463d2e7-f791-4518-96e7-5a612d61b8df (old id 466643)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:21:30
• date last changed: 2021-06-17 08:33:40