Advanced

Modeling Antibody Aggregation in Downstream Processing

Ojala, Frida LU (2015)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

Det blir allt vanligare att använda sig av medicin som liknar kroppens eget immunförsvar. Eftersom det ställs höga krav på att medicinen måste vara ren när den används så behöver man avskilja farliga substanser. I den här studien tittar vi på sådana reningsprocesser.

Antikroppar är en del av det naturliga immunförsvaret hos oss alla. De hjälper till att upptäcka och neutralisera bakterier och virus som kommer in i vår kropp. Idag kan man producera specifika antikroppar som bland annat kan användas som en del av cancerbehandling i olika former. Antikroppar produceras då i bioreaktorer, och man måste rena produkten från virus och andra föroreningar för att kunna använda den i... (More)
Popular Abstract in Swedish

Det blir allt vanligare att använda sig av medicin som liknar kroppens eget immunförsvar. Eftersom det ställs höga krav på att medicinen måste vara ren när den används så behöver man avskilja farliga substanser. I den här studien tittar vi på sådana reningsprocesser.

Antikroppar är en del av det naturliga immunförsvaret hos oss alla. De hjälper till att upptäcka och neutralisera bakterier och virus som kommer in i vår kropp. Idag kan man producera specifika antikroppar som bland annat kan användas som en del av cancerbehandling i olika former. Antikroppar produceras då i bioreaktorer, och man måste rena produkten från virus och andra föroreningar för att kunna använda den i medicin.

En av föroreningarna som produceras i bioreaktorerna är aggregat, vilket är flera antikroppar som bundit sig till varandra. Dessa aggregerat kan vara farliga att få in i kroppen då de kan få kroppens immunförsvar att reagera så att man blir sjuk. Man vill därför rensa bort dem under reningsprocessen. Det har dock visat sig att aggregat även bildas under separationen. Detta arbete syftar till att modellera reaktionen där antikroppar bildar aggregat och studera hur koncentrationen av antikropparna och aggregaten varierar under reningsprocessen.

Separationen av antikroppar från föroreningarna sker bland annat med kromatografi. Detta är en reningsprocess, där man använder sig av ett rör som är fyllt med mikroskopiska porösa partiklar med speciella egenskaper beroende på vilken grund separationen ska ske på. Vid gelfiltrering separeras ämnena på grund av att de har olika storlekar.

En ensam antikropp kallas för monomer. Under denna studie fanns endast monomerer och dimerer, vilket är två antikroppar som bundit till varandra. Undersökningen syftade till att titta på hur dimermängden påverkades av pH och salthalt. För att studera detta tog vi provrör i vilka pH, salthalt och antikroppskoncentration var olika. Från provrören togs med jämna mellanrum prover som analyserades med gelfiltrering. Proverna visade att dimerhalten ökade med minskad salthalt, och att ett lågt pH gör att aggregeringsreaktionen går snabbare.

För att ta reda på om reaktionen från monomerer till dimerer var reversibel, det vill säga om dimererna kunde dela upp sig till monomerer igen, gjordes ett försök där ett prov späddes ut från en högre koncentration till en lägre, samma som i ett referensprov, ovan markerat med blått. I figuren till vänster ser ni de tre förväntade resultaten. Om reaktionen var irreversibel skulle ingen förändring ske i dimerhalten, den skulle fortsätta enligt den heldragna röda linjen. Om den var delvis reversibel skulle den minska något, precis som den streckade linjen gör. Om den däremot var helt reversibel skulle dimerhalten nå hela vägen ner till den halt som finns i provet markerat med blå linje, så som den punktstreckade linjen gör. I figuren till höger ser ni att reaktionen var helt reversibel, eftersom dimerhalten går ner till samma som fanns i provet markerat med blåa stjärnor.

När detta var känt om reaktionen kunde den modelleras. Även kromatografiseparationen modellerades. Modellerna som vi använder för att simulera kromatografi är så pass mångsidiga att vi kunde visa på att de kunde användas för antikropprening, men också för separation av metalljoner som är mycket mindre i storlek än antikroppar.

Under separationen av antikroppar med gelfiltrering sker en utspädning. Eftersom vi visat att utspädning gör att man får tillbaka monomerer, kunde vi genom att slå samman reaktions- och kromatografimodellen visa att om man kör separationen långsamt får man tillbaka monomerer under själva separationen. Modellerna har också använts till att kunna studera hur dimerhalten förändras under stora delar av reningsprocessen. (Less)
Abstract
Antibodies are part of the immune system where their purpose is to recognize and neutralize foreign species such as viruses and bacteria, thus preventing and curing infections. The trend of using antibodies in the treatment of, for example, cancer is increasing. These antibodies are produced in bioreactors, but the production stream from the bioreactors also includes impurities such as viruses and host cell proteins. Antibody aggregates are also found in this stream, and can result in an immune response when they are injected into the body. A purification process is thus essential to ensure a safe product.

It has been shown that aggregation is not confined to the bioreactors, but also occurs during the purification process. The... (More)
Antibodies are part of the immune system where their purpose is to recognize and neutralize foreign species such as viruses and bacteria, thus preventing and curing infections. The trend of using antibodies in the treatment of, for example, cancer is increasing. These antibodies are produced in bioreactors, but the production stream from the bioreactors also includes impurities such as viruses and host cell proteins. Antibody aggregates are also found in this stream, and can result in an immune response when they are injected into the body. A purification process is thus essential to ensure a safe product.

It has been shown that aggregation is not confined to the bioreactors, but also occurs during the purification process. The work described in this thesis deals with the aggregation of antibodies in the downstream process, the influence of the buffer solution on aggregation, and how the purification process influences the degree of aggregation.

A facilitated method of measuring aggregation over time has been developed, including incubation of antibodies in various solutions, analysis of the degree of aggregation using size-exclusion chromatography, and calculation of antibody concentrations utilizing Gaussian curves. The effect of pH and salt content on aggregation in the mobile phase of a chromatography step and in solution has been studied. The results showed that only dimers are formed within the studied time frame (up to 13 days) and that the aggregation is reversible. The dimer fraction increased with decreasing salt concentration, and the rate of dimerization increased with decreasing pH. Modeling of chromatographic separation has been produced for monomers and dimers. The diversity of this kind of modeling was demonstrated by successfully utilizing similar models to predict separation of rare earth elements. The model of size exclusion separation of monomers and dimers showed that, given sufficiently long retention times, the dilution occurring in the mobile phase causes the reversible aggregation to reform monomers from dimers.

The batch-wise and continuous separation of monomers and dimers including dimer formation was modeled, and the change in dimer fraction occurring in the mobile phase during downstream processing was analyzed. The conclusion was that dimers are primarily formed during the virus inactivation step in the batch-wise process, when the pH and salt concentration are low. Use of continuous downstream processing, performing the virus inactivation in a size exclusion column instead of in a tank, greatly diminished the formation of dimers. This makes it a preferred process compared to batch-wise, from an aggregation point of view. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
supervisor
opponent
  • Prof Cramer, Steven M., Department of Chemical and Biological Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, Troy, NY, USA
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
Antibody, Aggregation, Downstream processing, Size exclusion chromatography, Reversible reaction model, General rate model
pages
120 pages
defense location
Lecture hall B, Kemicentrum, Getingevägen 60, Lund University, Faculty of Engineering LTH, Lund
defense date
2015-04-24 10:30
ISBN
978-91-7422-392-7
978-91-7422-391-0
language
English
LU publication?
yes
id
d8b56a20-f2e6-4c71-8c7b-13f3664ab3b6 (old id 5156656)
date added to LUP
2015-03-19 11:49:25
date last changed
2016-09-19 08:45:18
@misc{d8b56a20-f2e6-4c71-8c7b-13f3664ab3b6,
  abstract     = {Antibodies are part of the immune system where their purpose is to recognize and neutralize foreign species such as viruses and bacteria, thus preventing and curing infections. The trend of using antibodies in the treatment of, for example, cancer is increasing. These antibodies are produced in bioreactors, but the production stream from the bioreactors also includes impurities such as viruses and host cell proteins. Antibody aggregates are also found in this stream, and can result in an immune response when they are injected into the body. A purification process is thus essential to ensure a safe product.<br/><br>
It has been shown that aggregation is not confined to the bioreactors, but also occurs during the purification process. The work described in this thesis deals with the aggregation of antibodies in the downstream process, the influence of the buffer solution on aggregation, and how the purification process influences the degree of aggregation.<br/><br>
A facilitated method of measuring aggregation over time has been developed, including incubation of antibodies in various solutions, analysis of the degree of aggregation using size-exclusion chromatography, and calculation of antibody concentrations utilizing Gaussian curves. The effect of pH and salt content on aggregation in the mobile phase of a chromatography step and in solution has been studied. The results showed that only dimers are formed within the studied time frame (up to 13 days) and that the aggregation is reversible. The dimer fraction increased with decreasing salt concentration, and the rate of dimerization increased with decreasing pH. Modeling of chromatographic separation has been produced for monomers and dimers. The diversity of this kind of modeling was demonstrated by successfully utilizing similar models to predict separation of rare earth elements. The model of size exclusion separation of monomers and dimers showed that, given sufficiently long retention times, the dilution occurring in the mobile phase causes the reversible aggregation to reform monomers from dimers.<br/><br>
The batch-wise and continuous separation of monomers and dimers including dimer formation was modeled, and the change in dimer fraction occurring in the mobile phase during downstream processing was analyzed. The conclusion was that dimers are primarily formed during the virus inactivation step in the batch-wise process, when the pH and salt concentration are low. Use of continuous downstream processing, performing the virus inactivation in a size exclusion column instead of in a tank, greatly diminished the formation of dimers. This makes it a preferred process compared to batch-wise, from an aggregation point of view.},
  author       = {Ojala, Frida},
  isbn         = {978-91-7422-392-7},
  keyword      = {Antibody,Aggregation,Downstream processing,Size exclusion chromatography,Reversible reaction model,General rate model},
  language     = {eng},
  pages        = {120},
  title        = {Modeling Antibody Aggregation in Downstream Processing},
  year         = {2015},
}