Structure and Function of Beta-Mannanases from Glycoside Hydrolase Clan A. A Study of Hemicellulases from Microbes and a Mollusc

Abstract

Hemicellulose is the second most abundant group of renewable polysaccharides. Mannans can be found as the major hemicellulose in softwood and as storage polysaccharides in a range of plants. In this work, structural and functional characterisations of family 5 and 26 endo-1,4-b-mannanases (b-mannanases) have been performed. These families belong to the large and diverse glycoside hydrolase clan A, where the members exhibit the (b/a)8-barrel fold and a double displacement mechanism. b-mannanases hydrolyse the internal mannosidic bonds of mannan based polysaccharides. With increased knowledge in mannan degradation enzymology, we will be able to envision novel modifications of mannan-based polysaccharides for use in various applications. Furthermore, the transglycosylation capacity of these enzymes may be used for the synthesis of novel glyco-conjugates. This work has focused on three b-mannanases from different organisms exemplifying the diversity of this type of enzymes: CfMan26A from the bacterium Cellulomonas fimi (family 26), MeMan5A from the mollusc Mytilus edulis (family 5, subfamily 10) and HjMan5A from the filamentous fungus Hypocrea jecorina (family 5, subfamily 7). The three enzymes also show diversity in their respective modular organisation, CfMan26A consists of five modules, HjMan5A of two modules and MeMan5A consists of a sole catalytic module. Furthermore, CfMan26A has a mannanbinding module while HjMan5A has a cellulose-binding module. These modules are important in the overall function of the enzymes. The 3D-structures of CfMan26A and MeMan5A catalytic modules were solved by X-ray crystallography. A previously unknown immunoglobulin module was positioned in CfMan26A between the catalytic and the mannan-binding modules. MeMan5A is the first b-mannanase from an animal to be structurally characterised. Differences to the other family 5 b-mannanases were observed and we proposed that this b-mannanase should be assigned into a new subfamily (subfamily 10). Product patterns from mannotetraose hydrolysis experiments suggested that the three characterised enzymes had different subsite topologies. Structural and kinetic data was used to conduct partial subsite mapping. The data indicated that the distal +2 subsite has less importance in CfMan26A compared to MeMan5A and HjMan5A. Furthermore, CfMan26A and HjMan5A have five important subsites while MeMan5A uses at least six important subsites to achieve efficient hydrolysis. Interestingly, CfMan26A showed no indications of transglycosylation. Decreased level of transglycosylation was also observed for a +2 subsite mutant of HjMan5A, indicating the importance of the +2 subsite in transglycosylation. The increased knowledge in glycoside hydrolase specificity could assist us in designing novel enzymes that can recognise defined motifs of complex polysaccharides with high accuracy and efficiency.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Växter är en av den största grupperna av organismer på jorden. Den här gruppen av organismer kan syntesisera kolhydrater med solenergi. I växter används en stor del av kolhydraterna till att bilda förnyelsebara polysackarider som sedan används för att bygga upp vedstrukturer. Den mest kända växtpolysackariden är cellulosa som består av långa kedjor av glukos. Den näst mest förekommande gruppen av polysackariden i ved är hemicellulosa. Till skillnad från cellulosa kan hemicellulosa vara uppbyggd av flera typer av socker som mannos, galaktos, arabinos och xylos. De här polysackariderna namnges efter den dominerande sockertyper och får därefter namn som mannan, galaktan, arabinan och xylan. I detta arbete har den enzymatiska omsättningen av polysackariden mannan studerats. Mannan är den mest förekommande hemicellulosan i barrved och kan även förekomma i växtfrön där de fungerar som förvaringspolysackarider. Enorma mängder av cellulosa och hemicellulosa bildas årligen (1012 ton cellulosa). För att bibehålla balansen i ekosystemen krävs en kontinuerlig nedbrytning av dessa polysackarider. I denna förmultningsprocess spelar mikroorganismer en viktig roll. Kolhydrater är en universell energikälla för allt liv. Eftersom polysackarider ej kan uttnyttjas direkt i metabolismen är nedbrytning av dessa biopolymerer nödvändig för att monosackariderna ska kunna utnyttjas i cellernas metabolism. Till sin hjälp har mikroorganismerna utvecklat enzymer som kan frigöra monosackarider från cellulosa och hemicellulosa. De här enzymerna är oftast glykosidhydrolaser, dvs enzymer som hydrolyserar glykosidbindningarna i polysackarider. Dessa enzymer kan också utföra transglykosyleringsreaktioner. Dessa enzymer kan under särskilda omständigheter katalysera en syntes av nya oligosackarider (transglykosylering). I sådana fall tar en sackarid vattnets plats i hydrolysen och det bildas en ny glykosidbindning. Den här egenskapen kan potentiellt utnyttjas för att syntetisera polysackarider med nya egenskaper. Glykosidhydrolaser används idag inom industrin t.ex inom livsmedels och pappersmassa industrin.



En typ av glykosidhydrolaser b-mannanaser vilka spelar en mycket viktig roll i nedbrytningen av mannan. De här enzymerna hydrolyserar de interna mannosid bindningarna i mannaner. Med lärdom av hur enzymerna fungerar är det möjligt att genetiskt modifiera dessa enzymer för att vi dels ska kunna effektivisera dem men också för att kunna utnyttja enzymerna för att modifiera hemicellulosa. Genom att strukturellt och funktionellt karakterisera enzymerna kan vi få detaljerad information om hur de fungerar i detalj. I detta arbete har sådan karakterisering utförts på tre b-mannanaser: ett bakteriellt b-mannanas (CfMan26A), ett b-mannanas från svamp (HjMan5A) samt ett b-mannanas från blåmussla (MeMan5A). Enzymerna kommer från olika miljöer, organismer och enzymfamiljer. De är också olika i deras modulära uppbyggnad. CfMan26A består av fem moduler, HjMan5A av två moduler och MeMan5A består enbart av en katalytisk modul. CfMan26A har en mannanbindande modul medan HjMan5A har en cellulosabindande modul. De här modulerna är viktiga i enzymernas generella funktion genom att de kan ankra enzymet i närhet av substratet. Valet av enzymer demonstrerar diversiteten hos b-mannanaserna. I detta arbete löstes de tredimensionalla strukturerna för CfMan26A och MeMan5A med hjälp av röntgenkristallografi. Kristallstrukturen av CfMan26A visade en tidigare okänd immunoglobulin liknande modul positionerad mellan den katalytiska och den mannan bindande modulen. MeMan5A är det första b-mannanaset från ett djur som har blivit strukturellt karakteriserat. b-mannanaser har en aktiv klyfta där hydrolysen sker. Positioneringen av polysackariden är beroende av aminosyror som utgör så kallade bindningspositioner. En eller flera aminosyror som binder samma socker utgör en position och de namnges med positiva och negativa heltal t. ex. +2, +1, -1, -2. Hydrolysen sker mellan +1 och ?1 positionerna. Genom att undersöka vilka hydrolysprodukter som bildas av oligosackariden mannotetraos kunde skillnader i bindningspositionerna observeras. Strukturell och kinetisk data användes för att utföra en partiell kartläggning av bindningpositionerna. Resultaten visade att +2 positionen hade mindre betydelse för CfMan26A jämfört mot MeMan5A och HjMan5A. Det kunde också bestämmas att CfMan26A och HjMan5A utnyttjar bindning i fem positioner för att uppnå effektiv hydrolys medan MeMan5A behöver bindning i minst sex positioner för att uppnå effektiv hydrolys. Resultaten visade dessutom att CfMan26A inte kan utföra transglykosylering. Resultaten visade att +2 bindningpositionen i HjMan5A är viktig för att kunna utföra transglykosylering. Ökad förståelse av b-mannanaser och andra glykosidhydrolaser kan hjälpa oss att designa nya enzymer som kan känna igen definierade sekvenser hos komplexa polysackarider med hög effektivitet och precision.

• author: Anderson, Lars
• supervisor: Henrik Stålbrand
• opponent: Professor Gilbert, Harry, University of Newcastle upon Tyne, UK
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2006
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Proteiner, enzymologi, enzymology, Proteins, subsite organisation, transglycosylation, enzyme kinetics, beta-mannanase, hemicellulose
• pages: 124 pages
• defense location: Lecture hall A Center for Chemistry and Chemical Engineering Sölvegatan 39 Lund
• defense date: 2006-04-07 13:15:00
• ISBN: 91-7422-112-4
• language: English
• LU publication?: yes
• id: a8d72dea-19ae-45d6-9f11-dbc1f7662066 (old id 546449)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:13:21
• date last changed: 2018-11-21 21:03:27