Evolution of olfaction in Lepidoptera and Trichoptera : Gene families and antennal morphology

Abstract:
In moths, females produce sex pheromone compounds to attract males over a long distance for mating. The antennae of moths and many other insects have specialized odorant receptors (ORs), called pheromone receptors (PRs), to sense the pheromone compounds and they group in a monophyletic clade (PR clade).

In this thesis, I investigated and compared various components of the olfactory system in different species of Trichoptera and Lepidoptera (moths and butterflies). I made an effort to particularly understand the origin of the
PR clade, the pheromone binding proteins (PBPs) and other chemosensory genes, differences in antennal morphology, presence of Macro glomerular complex (MGC). I used a variety of experimental approaches ranging from microscopy studies, next-generation sequencing and in vitro functional characterization of receptors.

Eriocrania semipupurella (Eriocranidae: Lepidoptera) is more basal among the moths than Lampronia capitella (Prodoxidae: Lepidoptera). However, L. capitella is the most basal moth species using Type I pheromone compound. I functionally characterized three receptors from E. semipupurella, two of them responding to primitive pheromone compounds (Type 0 pheromone compounds) and structurally similar plant volatiles, indicating that these receptors likely have evolved from common plant volatile-detecting ORs. One receptor positioned at the base of the conserved pheromone receptor (PR) clade selectively responded to a plant volatile β-caryophyllene, which suggests that PRs of derived moths may also have evolved their function from plant volatile detecting ORs. In addition, a L. capitella specific clade of ORs falls in between the classical PR clade and the β-caryophyllene receptor. The functional activity of three L. capitella ORs, that responded to Type I sex pheromone compounds, suggests that the PR clade can be expanded with these receptors.

The antennal transcriptome analysis provided the first set of chemosensory gene families from Trichoptera and basal Lepidoptera. Furthermore, the L. capitella transcriptome comprised chemosensory genes that group within the PR and PBP clades, which contain specialized proteins involved in sex pheromone detection so far only reported in more derived, so-called ditrysian moths. These findings suggest that specialized chemosensory proteins have evolved in parallel with the transition of different sex pheromone types in Lepidoptera.

Antennal morphology studies revealed that there was a shift in the major sensilla type, from sensilla auricillica in Trichoptera to sensilla trichoidea in derived Lepidoptera. Preliminary results from immunocytochemistry studies of
antennal lobes show the presence of MGC-like structures in male E. semipupurella and both sexes of R. nubile which possibly are homologous to MGCs of derived moth. On the other hand, the MGC is present only in male AL
of L. capitella which may correspond to detection of female-produced pheromone compounds by the male. This is in line with what previously was shown in derived moths that pheromone detecting neurons of sensilla trichoidea
project into MGC and that these enlarged glomeruli are dimorphic and mostly present in males. Interestingly, in the butterfly Bicyclus anynana the MGC-like glomeruli seem to present only in female AL. In addition, the number of ORs found in the antennal transcriptome roughly correspond to the number of glomeruli’s found in the antennal lobes of R. nubila, E. semipurpurella and L. capitella.

My work on olfaction in Trichoptera and primitive Lepidoptera has demonstrated that (1) receptors involved in detection of Type 0 and I pheromone compounds have possibly evolved independently from different plant volatile detecting ORs, (2) the functional studies of L. capitella PRs add functional support to the PR clade, and (3) some Lepidoptera specific chemosensory proteins are only present in L. capitella which use Type I pheromone for sex communication. This illustrates that the chemosensory gene families, at least at the level of antennal expression may be associated with different pheromone types. (4) Similarly, antennal morphology studies show a shift in major types of olfactory sensilla, from sensilla placodea in basal moths to sensilla trichoidea in derived moths.


Resultaten i denna avhandling ökar vår kunskap om hur evolutionen av feromondetektering hos fjärilar gått till.

Luktsinnet är viktigt för de flesta djur, inklusive människor, hundar, insekter och många andra. Hos insekter, särskilt nattfjärilar och flugor, används luktsinnet för att hitta parningspartners, föda, äggläggningsställen och att undkomma fiender.

Feromoner är kemikalier som produceras och avges av en organism och som ändrar beteende eller fysiologi hos en annan individ inom samma art. Hos nattfjärilar är det för det mesta honan som avger feromoner, för att locka till sig hannar, ofta från långt håll. Hos insekterna är det antennen som har den funktion som vår näsa har, nämligen att känna dofter.

På antennens yta ryms en mängd hårliknande sensiller. Dessa sensiller rymmer doftreceptorer, som är proteiner inställda på att detektera specifika molekyler. Det finns ytterligare aktörer som är involverade i doftigenkänningsprocessen, och som är lokaliserade i sensillerna, och det är hjälp-receptorer, dvs. medmottagare till doftreceptorerna. Båda sitter i dendriterna, som är korta förgrenade nervcellsutskott. Kombinationen av doftreceptorer och dess hjälp-receptorer översätter doftinformationen som mottages och skickar in den i nervcellen. Nervcellen är av en speciell typ, som kallas doftigenkänningsnervcell. Den går från antennen in i en antennlob. I antennloben är de inkommande nervcellerna organiserade i något som kallas glomerulus, där den första bearbetningen av inkommande doftdata sker. Hos nattfjärilar som utvecklats relativt sent ur ett evolutionärt perspektiv finns i glomerulus särskilda ansamlingar, s. k. makroglomeruluskomplex, som enbart bearbetar feromonrelaterad information. Den bearbetade informationen i glomerulus skickas sedan vidare till högre nivåer i hjärnan, för vidare bearbetning. Detta kan slutligen leda till att utlösa ett beteende, t. ex. att börja flyga.

En särskild uppsättning av receptorer används för att känna igen olika ämnen, exempelvis används feromonreceptorer för att känna igen feromonämnen. Andra uppsättningar av receptorer används för att känna igen andra ekologiskt viktiga doftämnen, t. ex. värdväxtdofter. När en ny feromonsignal utvecklas, måste en motsvarande matchning av receptorerna hos mottagaren utvecklas, för att upprätthålla kommunikationen mellan den avsändande honan och den mottagande hannen.

Den mesta forskningen om feromonproduktion och -perception kopplat till beteende och fysiologi har hittills mest fokuserat på nattflyn och dagfjärilar. Mycket lite är känt om evolutionen hos feromonreceptorerna hos mer "primitiva" fjärilar, dvs. mer ursprungliga ur evolutionär synvinkel. För att förstå hur feromonreceptorerna utvecklats hos fjärilarna (ordningen Lepidoptera) är det viktigt att studera även dessa "primitiva" fjärilar.

I denna doktorsavhandling analyserar jag fyra insektsarter, som använder två olika slags feromontyper och som återfinns i intressanta positioner i insekternas fylogenetiska träd. Nattsländor (ordningen Trichoptera) är systergrupp till fjärilar (ordningen Lepidoptera). Nattsländan Rhyacophila nubila och den "primitiva" fjärilen vårpurpurmal (Eriocrania semipurpurella) använder båda en feromontyp som kallas Typ 0, en typ som kemiskt påminner om många växtsubstanser. Vinbärsknoppmal (Lampronia capitella) och den afrikanska dagfjärilen Bicyclus anyana använder däremot en feromontyp som kallas Typ I, som utgörs av mer långkedjiga föreningar med acetater, alkoholer eller aldehyder i ena molekyländen. För att få en bättre förståelse av hur dessa fjärilars och nattsländors luktorgan utvecklats jämför jag olika organ hos de fyra arterna. Men när det gäller Bicyclus anyana har bara antennmorfologi och antennlobsstrukturen studerats.

Jag använder antennvävnad för att identifiera de kemosensoriska gener som styr kemisk sensitering. Till hjälp har jag HEK-celler. HEK är en förkortning av
Human Embryonic Kidney, det vill säga celler från njuren hos mänskliga embryon. Med hjälp av HEK-celler kan jag uttrycka doftreceptorerna och testa deras reaktion på olika feromoner och växtdofter. Svepelektronmikroskopi och transmissionselekronmikroskopi används för att i mycket hög förstoring dokumentera morfologiska och strukturella detaljer hos sensillerna hos de fyra arterna. Immuncytokemiska metoder såsom infärgning används för att visualisera nervcellsuppbyggnaden i antennloben.

Den funktionella karakteriseringen av doftreceptorerna hos vårpurpurmalen identifierar för första gången receptorer som detekterar feromonkomponenter av Typ 0. Dessa receptorer reagerar till viss del även på strukturellt likartade växtdofter. Detta tyder på att feromonreceptorerna hos vårpurpurmalen har utvecklats genom att växtdoftreceptorer, som användes för att hitta värdväxter, modifierats till att bli feromonreceptorer. De funktionella studierna av receptorerna hos vinbärsknoppmalen visar å andra sidan för första gången feromonreceptorer hos den mest "primitiva" fjärilsgruppen som reagerar på feromoner av Typ I.

De morfologiska studierna av sensilltyperna hos nattsländan och nattfjärilar visar att det inträffat en stor evolutionär förändring, ett så kallat skifte, hos viktiga sensilltyper. För första gången visas att en insekt som använder feromon av Typ 0 har glomeruli som innehåller makroglomeruluskomplex. Jag visar också att hos vinbärsknoppmalen L. capitella och hos B. anyana förekommer makroglomerulusliknande strukturer bara hos det kön för vilket feromondetektering är viktigt, inte hos det andra könet.

Fortsatt forskning om genfamiljer som styr reaktioner på kemiska signaler hos de primitiva fjärilarna skulle ge ytterligare insikter i hur denna evolution gått till.