Investigating circulating microRNAs with next generation sequencing

Abstract

Abstract
In recent years focused research aimed at finding new specific and sensitive biomarkers for detection, classification and, monitoring of human cancers has been ongoing. MicroRNAs (miRNAs) are small, 19-24 nucleotides, noncoding RNAs that are stably expressed in body fluids such as blood. These circulating RNAs have shown great promise as biomarkers, because the unique expression patterns strongly correlate with certain human diseases, including various types of cancer. These miRNAs act mainly through down regulation of specific target mRNAs in the cytosol and have been shown to be key regulatory players in several important cellular processes. In this project sequence data of circulating small RNAs, 18-30 nucleotides, from blood serum were analyzed and compared to sequence data from blood cells and two blood cancer cell lines. The results showed that a surprisingly large part of the small RNAs in human serum did not match the human genome. Moreover, the results indicate the existence of several novel miRNAs in the human genome. When comparing the most frequent RNA molecules, differences between the compared samples were striking and several well described miRNAs showed up amongst these differently expressed RNAs. Despite huge progress in recent years, there are still more research needed in this field; most likely several novel miRNAs are still to be found in the human genome and, the involvement of certain miRNAs as key regulators in important cellular processes are to be expected. In some years to come, probably some miRNAs will prove to be reliable biomarkers for some specific trait.

Abstract (Swedish)

Små regulatoriska molekyler i vårt blod

Sedan det mänskliga genomet kartlades i början av 2000-talet har stora upptäckter gjorts och teknikutvecklingen har gått fort. Dagens sekvenseringsmaskiner är kraftfulla och kan sekvensera hela det mänskliga genomet på bara två dagar. I mitt masterarbete har jag undersökt små korta RNA-molekyler i mänskligt blod. Denna typ av molekyler är mycket lovande som framtida biomarkörer för identifikation av olika typer av sjukdomar, till exempel cancer.

Redan 1993 publicerades två artiklar författade av Victor Ambros och Gary Ruvkun. Artiklarna beskrev små korta, ungefär 22 nukleotider långa, RNA-molekyler som reglerar utvecklingen av en rundmask vid namn C. elegans. Dessa RNA-molekyler fick namnet mikro-RNA och författarna beskrev hur de reglerar produktionen av proteiner genom att binda och reglera budbärarmolekylen mRNA (messenger-RNA).

Nobelpriset i medicin 2006, gick till Andrew Fire och Craig Mello för upptäckten av RNA-interferens (RNAi). Själva upptäckten hade dessa två forskare publicerat i den vetenskapliga tidskriften Nature, i februari 1998. I korthet så beskriver denna upptäckt ett helt nytt reglersystem, som kan användas av forskare för att stänga av och på gener. Det visade sig att RNAi och mikro-RNA använder i stort sett samma system i cellen.

Tre sammanlänkade artiklar publicerades 2001 i den vetenskapliga tidskriften Science. I artiklarna beskrevs ungefär 100 stycken mikro-RNA upptäckta i det mänskliga genomet. Artiklarna fick stor genomslagskraft och många forskare runt om i världen började leta efter mikro-RNA i det mänskliga genomet. Idag tio år senare, finns det 2 527 stycken mikro-RNA, identifierade i människans genom, i en databas som samlar alla mikro-RNA från alla organismer.

För fem år sedan, 2008, publicerades fyra oberoende artiklar som alla beskrev mikro-RNA fritt cirkulerande i mänskans blod. Alla artiklarna visade att mikro-RNA var stabila i blod och på något sätt överkom att brytas ner av enzymer i blodet som förstör RNA molekyler. Upptäckten fick ett stort genomslag i forskarvärlden eftersom förhoppningar väcktes om att hitta sjukdomsassocierade mikro-RNA i blodet hos patienter. Vid denna tidpunkt hade många forskargrupper visat att uttrycket av specifika mikro-RNA är starkt kopplat till olika sjukdomar, framförallt olika typer av cancer.

I mitt projekt extraherade och isolerade jag mikro-RNA från mänskligt blod. Jag tillverkade sekvenseringsbibliotek men stötte på problem i slutanalyserna. Lösningen var att ladda ner 14 stycken redan publicerade sekvenseringsbibliotek och analysera dessa mot det mänskliga genomet. Detta material härstammade dels från blod och dels från vita blodceller och blodcancer cellinjer. I mina jämförelser kunde jag visa att en väldigt stor andel av de små sekvenserna i mänskligt blod ej härstammar från människa. Det fanns en skillnad mellan de mest förekommande sekvenserna i blod och i vita blodceller. Kartläggningen av mikro-RNA fritt cirkulerande i blod hos friska och sjuka individer har bara börjat och det återstår mycket spännande forskning inom detta område. Jag tror att inom ett par år kommer flera mikro-RNA visa sig vara lämpliga som markörer för sjukdomstillstånd och för att följa sjukdomsförlopp.

Handledare: Carlos Rovira
Examensarbete för masterexamen - molekylär genetik, 45 hp
Biologiska institutionen, Lunds universitet

• author: Lindberg, Mikael
• supervisor: Carlos Rovira
• organization: Degree Projects in Molecular Biology
• course: MOBN19 20112
• year: 2012
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 3627069
• date added to LUP: 2013-03-28 12:43:27
• date last changed: 2013-03-28 12:43:27