Development of an in vitro assay for analysis of cellular uptake of nanoparticles

Abstract

Abstract

MRI, magnetic resonance imaging, is used for disease detection such as assessing blood flow, detecting tumours and diagnosing many forms of cancer. Contrast agents are chemical substances that increase the MRI sensitivity. One class of contrast agents are the so called nanoparticulate contrast agents. Since tumour-associated formation of new blood vessels often results in highly permeable vessels, appropriately sized nanoparticles can selectively leak from the blood flow into the tumour interstitium and accumulate in tumours. This creates an increased difference in contrast between normal and abnormal tissue in an image.

Spago Imaging AB is developing a novel and tumour specific nanoparticle based contrast agent. In solving the clinical evaluation of the nanoparticle it is important to know how the nanoparticle interacts with specific cells and tissues types. In this thesis work, an in vitro based assay was developed so that one aspect of the nanoparticle cell interactions can be studied; cellular uptake.

The assay was developed using three reference particles, PEGylated gold nanoparticles and Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIO) which were in this study successfully functionalized with PEG1000 and APTMS. All three are known from literature to be internalized in certain cell lines [1-3]. HepG2 hepatocytes cells and human breast carcinoma cells MDA-MB-231 cells were used as models. By investigating the effect of cell density and amount, exposure time, nanoparticle concentration and particle surface characteristics, a functional assay could be set up. ICP-AES analysis and T1 and T2 relaxivity measurments showed that the internalization of nanoparticles occurred in a concentration dependant manner. The assay was used to test cellular uptake of a precursor of Spago Imaging AB Ion-X-gel, itself a staring material for the final contrast agent product. The findings indicated that the Ion-X-Gel precursor was internalized in a concentration dependent manner. The study also demonstrated that silane-coated SPIO nanoparticles possessed a higher in vitro labeling efficiency in HepG2 cells compared to PEG coated SPIO nanoparticles.

The results will give a better understanding of how the nanoparticles behave in a biological system and can in the long run help the developmental process to produce a product with the potential to provide more accurate diagnosis, earlier detection of tumours, a decrease in the number of false positives and above all, it could lead to less suffering for patients.

Abstract (Swedish)

Metodutveckling för analys av cellulärt upptag av nanopartiklar

Cancer är idag en utbredd sjukdom som tusentals människor världen över diagnostiseras för dagligen. Möjligheterna att få en korrekt behandling ökar om tumörer upptäcks i ett tidigt skede tidigt vilket ger en större chans att tillfriskna. Men detta har visat sig vara en utmaning då nuvarande metoder som används inte är av tillräckligt hög kvalitet. Traditionella diagnostiska metoder så som mammografi, datortomografi (CT) och positronemissionstomografi (PET) använder joniserande strålning som alla kan vara skadliga för normala celler och frisk vävnad. Magnetisk resonanstomografi, MRT, är en radiologisk diagnostisk metod som anses ge mer detaljerade bilder jämfört med andra alternativ och den är även mer skonsam. Kontrastmedel är kemiska substanser som ökar känsligheten i MRT vilket bidrar till ökade kontraster av strukturer i kroppen och möjliggör därmed känsligare analyser. En klass av kontrastmedel är så de kallade nanopartikulära kontrastmedlen. Dess interaktion med celler och vävnader kan studeras med in vitro studier.

Spago Imaging AB utvecklar ett nytt och tumörspecifik nanopartikel- baserat kontrastmedel. Det är viktigt att veta hur nanopartiklarna interagerar med specifika celler och vävnads-typer, om och hur partiklarna tas upp och transporteras i cellerna, och i vilken utsträckning de metaboliseras och utsöndras. Nanopartiklarna kan tas bort från cirkulationen och ackumuleras i t.ex. mjälten, levern eller benmärgen hos patienter och därmed orsaka toxicitet. För att få kunskap om sådana eventuella händelser är så kallade in vitro studier viktiga, där interaktionen mellan nanopartiklar och olika celltyper undersöks utanför kroppen. Kunskapen kan medföra större kontroll över cellulärt upptag och därmed kanske begränsa toxiska effekter, och öka de önskade effekterna.

Syftet med arbetet var att utveckla en in vitro baserad analysmetod som kan användas för att analysera cellulärt upptag av ett nanopartikulärt startmaterial för den slutliga Spago Imaging produkten. Upptaget av partiklarna förväntades vara lågt och därför var det viktigt att inkludera en referenspartikel i experimenten för att bekräfta experimentens funktion. Metoden utvecklades med tre referenspartiklar; guldnanopartiklar och superparamagnetiska järnoxid (SPIO) nanopartiklar, som i denna studie var funktionaliserade med silan och PEG molekyler. Levercellscancer HepG2-celler och humana bröst karcinomceller MDA-MB-231-celler användes som modeller. Olika experiment genomfördes där parametrar så som cellantal, celldensitet, exponeringstid av nanopartiklarna och nanopartiklarnas koncentration förändrades. Effekterna av de förändrade parametrarna undersöktes efter varje experiment och optimerades inför nästkommande experiment. Med hjälp av ICP-AES analys och relaxivitetmätningar kunde upptaget av nanopartiklarna påvisas. Upptaget av PEGylerade SPIO visades vara koncentrationsberoende och upptaget av järn kunde även visuellt bekräftas med Prussian Blue infärgning, en metod som färgar järn.

De slutgiltiga resultaten indikerade att en funktionell analys metod för att studera upptaget av nanopartiklar med PEGylerade SPIO som en positiv kontroll, uppnåddes. Jämförelse av upptag av silaniserade och PEGylerade SPIO i HepG2-celler testades med hjälp den utvecklade metoden och resultaten visade att silaniserade SPIO togs upp av cellerna i högre utsträckning jämfört med PEGylerade SPIO. Detta indikerade att även silaniserade SPIO skulle potentiellt kunna användas som positiv kontroll. Den utvecklade metoden användes slutligen för att undersöka nivån av upptag av startmaterialet till Spago Imagings nanopartiklar i HepG2-celler. Resultaten indikerade att internalisering av nanopartikeln sker på ett koncentrationsberoende sätt.

Resultaten kommer förhoppningsvis kunna bidra till att skapa en bättre förståelse för hur nanopartiklarna beter sig i biologiska system. På lång sikt kan detta hjälpa utvecklingsprocessen av nanopartikeln för att framställa en produkt med potential att ge en mer exakt diagnos, en tidigare upptäckt av mindre tumörer, en minskning av antalet av falska positiva och framför allt kan det leda till mindre lidande för patienterna.

Handledare: Emil Aaltonen
Examensarbete för masterexamen - cell- och molekylärbiologi 30 hp
Biologiska institutionen, Lunds universitet

• author: Olsson, Lina
• supervisor: Emil Aaltonen
• organization: Degree Projects in Molecular Biology
• course: MOBM15 20122
• year: 2013
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 4053803
• date added to LUP: 2013-09-18 16:05:47
• date last changed: 2013-09-18 16:05:47