Advanced

Cloning, expression and production of Vicia faba Leghemoglobin B

Lindéus, Gustav LU (2016) KBK820 20161
Pure and Applied Biochemistry
Abstract
In this thesis a preliminary evaluation of the potential of a leghemoglobin (Lb) for the development of a blood substitute in humans, resembling hemoglobin (Hb) in red blood cells, was conducted. Leghemoglobin B (VfLbB), a gene from Vicia faba, was cloned into a pET-DEST42 vector, using the Gateway™ recombination technology. The recombinant vector containing VfLbB was sequenced and confirmed. Then it was transformed into an Escherichia coli BL21-DE3 strain. Seven shake flasks experiments, with volumes ranging from 250 to 660 ml, were conducted. One experiment was dedicated to constructing a bacterial growth curve and the rest to express VfLbB. In four out of these six protein expression experiments, various parameters related to the... (More)
In this thesis a preliminary evaluation of the potential of a leghemoglobin (Lb) for the development of a blood substitute in humans, resembling hemoglobin (Hb) in red blood cells, was conducted. Leghemoglobin B (VfLbB), a gene from Vicia faba, was cloned into a pET-DEST42 vector, using the Gateway™ recombination technology. The recombinant vector containing VfLbB was sequenced and confirmed. Then it was transformed into an Escherichia coli BL21-DE3 strain. Seven shake flasks experiments, with volumes ranging from 250 to 660 ml, were conducted. One experiment was dedicated to constructing a bacterial growth curve and the rest to express VfLbB. In four out of these six protein expression experiments, various parameters related to the induction of VfLbB expression were optimized. The two last shake flasks experiments were conducted with the optimized conditions. After the shake flask experiments, the production was scaled up to a five liter fermenter, where three fermentations were carried out. The first fermentation was dedicated to construct a bacterial growth curve and the other two to express VfLbB. Cells from the optimized shake flask cultivations and from the fermentations were sonicated in order to extract VfLbB. Attempts were done to purify VfLbB by carrying out ion exchange chromatography. Two different media were used: CaptoS (cation exchange) and QFF (anion exchange). Unfortunately, no positive results were obtained indicating that the purification needs to be further optimized. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Hemoglobin är ett viktigt protein. Det återfinns i röda blodkroppar och dess huvudfunktion är att transportera syre genom kroppen. Hemoglobin är komplext till sin struktur, till exempel består proteinet av fyra subenheter. I människor återfinns två varianter: vuxet och fetalt. Förmågan att binda syre, affiniteten, skiljer sig åt mellan dessa. I fetalt hemoglobin är syreaffiniteten högre än i vuxet. På grund av denna egenskap underlättas syretransporten mellan fostret och modern under graviditeten. Bortsett från syre, binder hemoglobin även kolmonoxid.

Tanken att introducera fritt hemoglobin i blodet som blodsubstitut och blodersättning har varit ett forskningsfenomen sedan slutet av 1800-talet. Detta forskningsområde är nu benämnt... (More)
Hemoglobin är ett viktigt protein. Det återfinns i röda blodkroppar och dess huvudfunktion är att transportera syre genom kroppen. Hemoglobin är komplext till sin struktur, till exempel består proteinet av fyra subenheter. I människor återfinns två varianter: vuxet och fetalt. Förmågan att binda syre, affiniteten, skiljer sig åt mellan dessa. I fetalt hemoglobin är syreaffiniteten högre än i vuxet. På grund av denna egenskap underlättas syretransporten mellan fostret och modern under graviditeten. Bortsett från syre, binder hemoglobin även kolmonoxid.

Tanken att introducera fritt hemoglobin i blodet som blodsubstitut och blodersättning har varit ett forskningsfenomen sedan slutet av 1800-talet. Detta forskningsområde är nu benämnt hemoglobin based oxygen carriers, HBOCs. Det finns dock utmaningar vad beträffar HBOCs. På grund av dess storlek i relation till övriga molekyler i blodet, filtreras fritt hemoglobin ut av njurarna och det är giftigt för dess nephroner. Ett annat exempel är att molekylerna kan korsa blodkärlsbarriärerna. För att lösa dessa utmaningar pågår forskning för att exempelvis kemiskt modifiera hemoglobinmolekylen så väl som gentekniska metoder. Rekombinanta hemoglobin med olika egenskaper har blivit producerade genom åren.

Växter har, precis som människor och djur, också hemoglobin. Det finns tre varianter av växthemoglobin: symbiotiska, icke-symbiotiska och trunkerade. Symbiotiska växthemoglobiner finns i rothår som är i symbios med kvävefixerande bakterier. Denna symbiotiska relation återfinns inte i icke-symbiotiska och trunkerade växthemoglobiner, utan de har andra funktioner i växter.

Symbiotiska växthemoglobin kallas ofta leghemoglobin eftersom de återfinns till stor del i släktet leguminosa, som inkluderar exempelvis Vicia faba, bondböna och Lupinus luteus, gul lupin. Leghemoglobiner är mindre komplexa till sin struktur än hemoglobin, då de består av en subenhet, till skillnad från fyra. Precis som fetalt hemoglobin, har leghemoglobiner hög syreaffinitet. Som blodsubstitut har leghemoglobiner teoretiskt stor potential, till exempel skulle dess syrebindningsegenskaper kunna vara applicerbart i akuta tillstånd med hypoxi så som trauma då hypovolemi kan förekomma. Vid en stor blödning minskar syretillförseln till kroppens vävnader eftersom mängden hemoglobin är en faktor som påverkar syretillförseln. Bortsett från hypovolemi skulle detta kunna vara applicerbart vid hjärt- och hjärninfarkter, förutsatt att dessa partiklar skulle kunna passera genom blodproppar, om detta skulle vara orsaken.

Huvudsyftet med detta examensarbete var att klona genen av leghemoglobin B från Vicia faba (VfLbB), bondböna, för att sedan producera dess protein och upprena det. Detta var en preliminär utvärdering för potentialen av ett leghemoglobin att utvecklas till ett framtida blodsubstitut i människor, liknande hemoglobin i röda blodkroppar.

Genkloningsfasen använde en teknik baserad på genetisk rekombination och dess resultat var externt bekräftat. VfLbB-genen var introducerad i Escherichia coli, som agerade värd för proteinproduktionen. Proteinproduktionen ägde först rum i skakflaskor. Spektrofotometriska metoder bekräftade att VfLbB producerades och även att det var aktivt genom inbindning av kolmonoxid. Sju större skakflaskexperiment genomfördes. Fyra av dessa experiment var tillägnade åt processoptimering där fem viktiga parametrar systematiskt testades.

Produktionen av VfLbB skalades sedan upp till en automatiserad fermentor, bioreaktor, där två proteinproduktioner ägde rum. Det var möjligt att producera proteinet initialt och koncentrationerna var i samma storleksordning som i skakflaskorna, men på grund av tidsbrist gavs ingen tid åt processoptimering i fermentorn. Ett försök till att upprena VfLbB med dialys och jonbyteskromatografi gjordes, men detta utan framgång.

Det arbete som har åstadkommits med VfLbB i detta examensarbete är ett första steg på vägen till ett potentiellt framtida blodsubstitut. Proteinet är mindre komplext till sin struktur än mänskligt hemoglobin och har hög syreaffinitet, vilket teoretiskt sätt skulle kunna vara applicerbart i akuta tillstånd med hypoxi. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Lindéus, Gustav LU
supervisor
organization
course
KBK820 20161
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
keywords
blood substitute, fermentation, gene technology, Leghemoglobin, hemoglobin, Vicia faba, applied biochemistry, tillämpad biokemi
language
English
id
8880323
date added to LUP
2016-06-17 10:45:44
date last changed
2016-06-17 10:45:44
@misc{8880323,
  abstract     = {In this thesis a preliminary evaluation of the potential of a leghemoglobin (Lb) for the development of a blood substitute in humans, resembling hemoglobin (Hb) in red blood cells, was conducted. Leghemoglobin B (VfLbB), a gene from Vicia faba, was cloned into a pET-DEST42 vector, using the Gateway™ recombination technology. The recombinant vector containing VfLbB was sequenced and confirmed. Then it was transformed into an Escherichia coli BL21-DE3 strain. Seven shake flasks experiments, with volumes ranging from 250 to 660 ml, were conducted. One experiment was dedicated to constructing a bacterial growth curve and the rest to express VfLbB. In four out of these six protein expression experiments, various parameters related to the induction of VfLbB expression were optimized. The two last shake flasks experiments were conducted with the optimized conditions. After the shake flask experiments, the production was scaled up to a five liter fermenter, where three fermentations were carried out. The first fermentation was dedicated to construct a bacterial growth curve and the other two to express VfLbB. Cells from the optimized shake flask cultivations and from the fermentations were sonicated in order to extract VfLbB. Attempts were done to purify VfLbB by carrying out ion exchange chromatography. Two different media were used: CaptoS (cation exchange) and QFF (anion exchange). Unfortunately, no positive results were obtained indicating that the purification needs to be further optimized.},
  author       = {Lindéus, Gustav},
  keyword      = {blood substitute,fermentation,gene technology,Leghemoglobin,hemoglobin,Vicia faba,applied biochemistry,tillämpad biokemi},
  language     = {eng},
  note         = {Student Paper},
  title        = {Cloning, expression and production of Vicia faba Leghemoglobin B},
  year         = {2016},
}