Advanced

Analysis of inducible protein factor degrading apo-catalase in Enterococcus faecalis

Lichtenberg, Oskar (2016) MOBT01 20161
Degree Projects in Molecular Biology
Abstract
Catalase is a heme-containing homo-tetrameric enzyme that catalyzes the degradation of hydrogen peroxide. Apo-catalase is in the bacterium Enterococcus faecalis produced also in the absence of heme. In this work I have enriched and studied proteolytic activity causing apo-catalase degradation in stationary growth phase E. faecalis cells. The activity was enriched from soluble cell free extract of a catalase null mutant strain through fractionation by ammonium sulphate precipitation, ion exchange chromatography and gel filtration chromatography. I purified hexahistidyl- tagged holo- and apo-catalase from E. faecalis cells and identified the N-terminal amino acid sequence of the catalase polypeptide. The rate of degradation of purified... (More)
Catalase is a heme-containing homo-tetrameric enzyme that catalyzes the degradation of hydrogen peroxide. Apo-catalase is in the bacterium Enterococcus faecalis produced also in the absence of heme. In this work I have enriched and studied proteolytic activity causing apo-catalase degradation in stationary growth phase E. faecalis cells. The activity was enriched from soluble cell free extract of a catalase null mutant strain through fractionation by ammonium sulphate precipitation, ion exchange chromatography and gel filtration chromatography. I purified hexahistidyl- tagged holo- and apo-catalase from E. faecalis cells and identified the N-terminal amino acid sequence of the catalase polypeptide. The rate of degradation of purified apo-catalase was determined using two methods - Western blot and an in this work developed procedure called Loss of catalase activity assay. Several features of the apo-catalase degrading activity were characterized such as protease inhibitor sensitivity, optimal pH and temperature, and molecular size. A polypeptide of about 25 kDa dominated in highly enriched protease preparation and was tentatively identified as a peptidyl-prolyl cis-trans isomerase. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Hur bryts apo-katalas ned i bakterien Enterococcus faecalis?

Väteperoxid, H2O2, är ett kemiskt ämne som används som blekningsmedel för allt från papper till hår. Det används också i somliga bränslen och desinfektionsmedel. Celler producerar vanligtvis väteperoxid som en biprodukt av sin metabolism. I celler ställer väteperoxid till potentiella problem då ämnet kan orsaka bildning av ”fria radikaler”. Dessa fria radikaler är väldigt reaktiva och skadar ibland bland annat cellens DNA. För att skydda sig mot sådana skador omvandlar cellerna väteperoxid till vatten och syrgas med hjälp av ett enzym som heter katalas.
Nästan allt liv har katalas som är ett otroligt snabbverkande enzym. En katalas enzym molekyl kan omvandla flera miljoner... (More)
Hur bryts apo-katalas ned i bakterien Enterococcus faecalis?

Väteperoxid, H2O2, är ett kemiskt ämne som används som blekningsmedel för allt från papper till hår. Det används också i somliga bränslen och desinfektionsmedel. Celler producerar vanligtvis väteperoxid som en biprodukt av sin metabolism. I celler ställer väteperoxid till potentiella problem då ämnet kan orsaka bildning av ”fria radikaler”. Dessa fria radikaler är väldigt reaktiva och skadar ibland bland annat cellens DNA. För att skydda sig mot sådana skador omvandlar cellerna väteperoxid till vatten och syrgas med hjälp av ett enzym som heter katalas.
Nästan allt liv har katalas som är ett otroligt snabbverkande enzym. En katalas enzym molekyl kan omvandla flera miljoner väteperoxid molekyler per minut. Enzymet består, i sin vanligaste form, av fyra identiska subenheter som greppar varandra i en relativt komplicerad struktur där subenheterna veckas in i varandra. Var och en av de fyra subenheterna huserar en heme grupp. Heme är en organisk cyklisk molekyl med en järn-jon inbunden i mitten. Andra protein som innehåller heme är t.ex. hemoglobin i röda blodkroppar.
Mycket är redan känt om katalas då det har studerats i över 100 år sen det upptäcktes 1900 av Oscar Loew. Genetiken bakom proteinet och dess struktur är väldokumenterad men hur heme gruppen sätts in och hur proteinet veckas och kombinerar de fyra subenheterna till det fullständiga enzymet är mer av ett mysterium. Faktum är att biogenes av heme-proteiner över huvud taget är rätt okänd. Genom att studera hur katalas sätts ihop kan man lära sig mer om heme-proteiners biogenes.
Jag började med att i provröret undersöka hur heme-gruppen inkorporeras i enzymet. Sådana experiment har gjorts tidigare och visat att heme kan inkorporeras i renframställt heme-löst katalas protein, så kallat apo-katalas. Det resulterande enzymet har låg aktivitet eller bildas långsamt vilket tyder på att det finns proteiner i cellerna som hjälper till så att proteinet effektivt sätts ihop.
Apo-katalas renframställdes från Enterococcus faecalis bakterieceller. E. faecalis är en bakterie som kan leva utan funktionellt katalas och kan inte producera eget heme och tillverkar heme-löst katalas om heme inte finns i omgivningen. Ett problem, som också observerats tidigare, är att apo-katalas bryts ned i icke växande celler. För att mäta apo-katalas nedbrytning använde jag både tidigare beprövade metoder och utvecklade en egen metod baserad på omvandlingen av väteperoxid till vatten och syrgas. För att kunna framställa stora mängder apo-katalas behöver denna nedbrytning av apo-katalas förhindras. Målsättningen med projektet var att identifiera det agens, troligtvis ett eller flera proteaser, som bryter ned apo-katalas i bakterien E. faecalis. För att finna denna apo-katalas-nedbrytande aktivitet fraktionerades bakteriecellens proteiner efter deras olika egenskaper, såsom löslighet i vatten, ytladdning och storlek. Erhållna fraktioner med olika proteiner testades sedan för förekomst av den nedbrytande aktiviteten. Prover som visade på hög aktivitet fraktionerades vidare. Till slut erhölls ett prov innehållande huvudsakligen ett enda protein. Detta protein skickades till sekvenseringsanalys och visade sig vara ett ”peptidyl-prolyl cis-trans isomeras”. Sådana enzym är inte kända för att vara proteinnedbrytande utan har som funktion att bidra till veckning av proteiner.
Det kanske är så att det är flera olika cellkomponenter inblandade i nedbrytning av apo-katalas och att isomeraset behövs för att vecka apo-katalas så att det snabbt kan brytas ner i cellen.

Handledare: Lars Hederstedt
Masterexamen i Molekylärbiologi 60hp, 2016
Biologiska institutionen, Lunds universitet (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Lichtenberg, Oskar
supervisor
organization
course
MOBT01 20161
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
language
English
id
8891549
date added to LUP
2016-09-13 10:00:40
date last changed
2016-09-13 10:00:40
@misc{8891549,
  abstract     = {Catalase is a heme-containing homo-tetrameric enzyme that catalyzes the degradation of hydrogen peroxide. Apo-catalase is in the bacterium Enterococcus faecalis produced also in the absence of heme. In this work I have enriched and studied proteolytic activity causing apo-catalase degradation in stationary growth phase E. faecalis cells. The activity was enriched from soluble cell free extract of a catalase null mutant strain through fractionation by ammonium sulphate precipitation, ion exchange chromatography and gel filtration chromatography. I purified hexahistidyl- tagged holo- and apo-catalase from E. faecalis cells and identified the N-terminal amino acid sequence of the catalase polypeptide. The rate of degradation of purified apo-catalase was determined using two methods - Western blot and an in this work developed procedure called Loss of catalase activity assay. Several features of the apo-catalase degrading activity were characterized such as protease inhibitor sensitivity, optimal pH and temperature, and molecular size. A polypeptide of about 25 kDa dominated in highly enriched protease preparation and was tentatively identified as a peptidyl-prolyl cis-trans isomerase.},
  author       = {Lichtenberg, Oskar},
  language     = {eng},
  note         = {Student Paper},
  title        = {Analysis of inducible protein factor degrading apo-catalase in Enterococcus faecalis},
  year         = {2016},
}