Advanced

Optimizing the Protein Expression of the Cancer Associated Nucleosome Remodeling and Deacetylase Complex: a Study Investigating Both Mammalian and Insect Cells

Wybrands, Ninnie LU (2016) KBK820 20161
Pure and Applied Biochemistry
Abstract
The Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) complex is a transcriptional regulator essential to several normal developmental processes, but also found to have a role in several types of cancer. In order to design cancer therapies targeting this complex, determining the structure and subunit composition is crucial. X-ray crystallography is required for the level of detail desired, demanding large amounts of protein. This project aims to i) optimize the expression of NuRD components in mammalian cells, with additives and changed conditions, and ii) express and purify NuRD components in insect cells, using the MultiBac system. The mammalian optimization investigated adding valproic acid, XLG plasmids encoding cell cycle regulators (p18h... (More)
The Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) complex is a transcriptional regulator essential to several normal developmental processes, but also found to have a role in several types of cancer. In order to design cancer therapies targeting this complex, determining the structure and subunit composition is crucial. X-ray crystallography is required for the level of detail desired, demanding large amounts of protein. This project aims to i) optimize the expression of NuRD components in mammalian cells, with additives and changed conditions, and ii) express and purify NuRD components in insect cells, using the MultiBac system. The mammalian optimization investigated adding valproic acid, XLG plasmids encoding cell cycle regulators (p18h and p21h) and a growth factor (aFGF), and varying cell density and incubation time. None of the conditions increased the expression levels of all NuRD components tested, but rather, different NuRD components were expressed differently by different additives. Further investigations are required, establishing which additives to use with which NuRD components. However, adding both valproic acid and aFGF showed great potential. The MultiBac system required several steps: extensive cloning, baculovirus production, protein expression and purification. Inserting a third gene into pFBDM failed, but baculovirus of HDAC1 was produced, followed by successful HDAC1 expression in baculovirus-infected HighFive insect cells. The purification, using Ni-beads, was poor, as the beads bound many other proteins than the desired ones, and not all expected bands were visible. Whether or not the MultiBac system can outcompete the mammalian cells in NuRD expression levels is too early to determine, but the protein expression was very promising, and the system can likely be evaluated after sufficient optimization of especially purification. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Hur ser vår inre NuRD ut?
NuRD är ett molekylkomplex som arbetar med att slå på och av gener i vårt DNA. Man har upptäckt att NuRD ibland stänger av gener som normalt verkar för att hämma cancer. Om man kunde ta reda på den exakta strukturen av NuRD så skulle man kunna designa läkemedel som hindrar NuRD från att stänga av våra naturliga cancerhämmare.

Vår arvsmassa är samlad som en kod i en värdefull molekyl, omsorgsfullt paketerad och skyddad i en egen kärna i mitten av varje cell. Molekylen är det vi kallar för DNA, och den avgör hur vi ser ut och hur vår kropp fungerar. DNA är som en enorm receptbok, fylld av gener, precis som recept, och varje cell har fått med sig vars ett exemplar. Men hur ser vi till att cellerna bara... (More)
Hur ser vår inre NuRD ut?
NuRD är ett molekylkomplex som arbetar med att slå på och av gener i vårt DNA. Man har upptäckt att NuRD ibland stänger av gener som normalt verkar för att hämma cancer. Om man kunde ta reda på den exakta strukturen av NuRD så skulle man kunna designa läkemedel som hindrar NuRD från att stänga av våra naturliga cancerhämmare.

Vår arvsmassa är samlad som en kod i en värdefull molekyl, omsorgsfullt paketerad och skyddad i en egen kärna i mitten av varje cell. Molekylen är det vi kallar för DNA, och den avgör hur vi ser ut och hur vår kropp fungerar. DNA är som en enorm receptbok, fylld av gener, precis som recept, och varje cell har fått med sig vars ett exemplar. Men hur ser vi till att cellerna bara tillagar sånt vi behöver, och att alla inte tillagar samma sak? Det måste finnas ett system som avgör om en cell ska koka ihop mer ben för att man är ett växande barn, mer hud för att läka ett sår, färre könshormoner för man blivit äldre, eller mer blod för att man gett bort massa.

Våra gener ligger på rad i den otroligt långa DNA-molekylen, som är inpackad enormt kompakt och strukturerat, för att få plats i den där lilla kärnan. Hur fungerar DNAt då? Om cellen är en fabrik, så är cellkärnan ett chefskontor. På kontoret arbetar massvis med assistenter som går runt och gör kopior av generna, för att skicka vidare dessa ut till fabriken så att maskinerna kan tillverka det protein som genen beskriver. Assistenterna kan däremot inte kopiera vad som helst. På kontoret sitter nämligen cheferna också, som arbetar i olika team. När någonting behöver produceras så går ett helt team bort till genen, som ju är ordentligt gömd i det kompakta DNAt, och hjälps åt för att snyggt packa upp genen och göra den synlig för assistenterna. Genen har därmed aktiverats och assistenterna kommer snabbt upptäcka att genen går att skriva av för produktion. På precis samma sätt så packas gener ihop när dom inte behövs mer.

En av cellkärnans alla team är NuRD-komplexet (Nucleosome Remodeling and Deacetylase complex), som framförallt är specialiserat på att packa ihop gener, och alltså stänga av dom. Komplexet är nödvändigt för flera olika typer av utvecklingsstadier i vår kropp, till exempel att utveckla stamceller till blodkroppar. När man forskat på cancer har man sett att det här komplexet dyker upp i flera olika typer av tumörer. Vid närmre undersökning har man upptäckt att NuRD bidrar till att stänga av gener som normalt verkar för att hämma cancer. Det kluriga i det hela, är att det verkar som att NuRD både främjar och motverkar cancer, beroende på var i kroppen tumören sitter, och vilka chefer komplexet består av. Om man visste exakt hur många chefer som utgör komplexet, och exakt vilken struktur NuRD får då, så skulle man kunna designa läkemedel som hindrar NuRD från att stänga av våra naturliga cancerhämmare.

Man vet vilka gensekvenser som motsvarar proteinerna (cheferna) i NuRD, men det säger ingenting om strukturen. Strukturbestämning görs bäst med röntgenkristallografi, vilket kräver stora mängder av NuRD. På laboratorier kan man odla celler, mänskliga som bakteriella, som producerar precis det protein man vill. Men alla proteiner är inte lika enkla att tillverka, och i dagsläget framställer inte människoceller tillräckligt mycket NuRD för röntgenkristallografi. Utmaningen i det här projektet var att optimera produktionen av NuRD, dels i människoceller, men dels också i insektsceller, för att se om dom kan producera mer. Projektets tid var alldeles för kort för att avgöra vilka celler som är bäst, men både människocellerna och insektscellerna visade lovande resultat. Efter några ytterligare förbättringar bör produktionen ge tillräckliga mängder för att bestämma sammansättningen och strukturen av NuRD, så att ett sådant läkemedel mot cancer kan börja utvecklas! (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Wybrands, Ninnie LU
supervisor
organization
course
KBK820 20161
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
keywords
mammalian cells, PCR, Cancer, Nucleosome, insect cells, applied biochemistry, tillämpad biokemi
language
English
id
8893894
date added to LUP
2016-11-08 09:08:45
date last changed
2016-11-08 09:08:45
@misc{8893894,
  abstract     = {The Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) complex is a transcriptional regulator essential to several normal developmental processes, but also found to have a role in several types of cancer. In order to design cancer therapies targeting this complex, determining the structure and subunit composition is crucial. X-ray crystallography is required for the level of detail desired, demanding large amounts of protein. This project aims to i) optimize the expression of NuRD components in mammalian cells, with additives and changed conditions, and ii) express and purify NuRD components in insect cells, using the MultiBac system. The mammalian optimization investigated adding valproic acid, XLG plasmids encoding cell cycle regulators (p18h and p21h) and a growth factor (aFGF), and varying cell density and incubation time. None of the conditions increased the expression levels of all NuRD components tested, but rather, different NuRD components were expressed differently by different additives. Further investigations are required, establishing which additives to use with which NuRD components. However, adding both valproic acid and aFGF showed great potential. The MultiBac system required several steps: extensive cloning, baculovirus production, protein expression and purification. Inserting a third gene into pFBDM failed, but baculovirus of HDAC1 was produced, followed by successful HDAC1 expression in baculovirus-infected HighFive insect cells. The purification, using Ni-beads, was poor, as the beads bound many other proteins than the desired ones, and not all expected bands were visible. Whether or not the MultiBac system can outcompete the mammalian cells in NuRD expression levels is too early to determine, but the protein expression was very promising, and the system can likely be evaluated after sufficient optimization of especially purification.},
  author       = {Wybrands, Ninnie},
  keyword      = {mammalian cells,PCR,Cancer,Nucleosome,insect cells,applied biochemistry,tillämpad biokemi},
  language     = {eng},
  note         = {Student Paper},
  title        = {Optimizing the Protein Expression of the Cancer Associated Nucleosome Remodeling and Deacetylase Complex: a Study Investigating Both Mammalian and Insect Cells},
  year         = {2016},
}