Site localisation on bacterial surface proteins using super resolution imaging

Abstract

Several significant pathogenic bacteria exhibit surface proteins that bind human antibodies, preventing them from being recognized by the human immune system. These bacteria
are thus protected from elimination and can survive in the host organism. One common
such bacteria is the Streptococcus pyogenes that exhibits the antibody binding M protein
on its surface. Streptococcus pyogenes causes more than 700 million uncomplicated throat
and skin infections annually and can be at root of rare but very serious invasive infections
such as sepsis. Understanding the mechanism behind the binding tendencies of Streptococcus pyogenes may thus help explain what causes this significant difference in prevalence of
infectious severity.
The aim of this study was to evaluate whether or not the super-resolution techniques
stimulated emission depletion (STED) and stochastic optical reconstruction microscopy
(STORM) are viable optical techniques for relative localization studies of bacteria-bound antibodies. Binding sites on bacterial surface proteins were localised using the IgGFc-binding
site on M protein as its location was known beforehand. The bacterial membrane was
adopted as a reference region.
The necessary resolution required for site localisation on M proteins was acquired by
applying statistical methods based on particle averaging and deconvolution on high resolution images. STED and STORM images were taken of samples prepared and analysed in
the same manner. The two super-resolution techniques were compared to one another in
terms of image quality, practicality and more specifically for the use of site localisation on
bacterial surface proteins.
The distance between the membrane and the binding site on the M protein was calculated
with the STED images to be 43.5±3.6 nm which may be a reasonable result according to previous data. The mean distance in the STORM images was calculated to be 124.8±134.3
nm suggesting that the STORM procedure may require more optimisation. Interestingly,
even though the image quality was low in the confocal images, the mean distance determined
with these was 43.5±4.7nm which is a reasonable distance with a narrow confidence interval.
Deconvolution did not seem to have a significant impact on any set of images. According
to our results, STED together with a particle averaging method, may be an appropriate
technique for relative site localisation studies on bacterial surface proteins. Our results also
suggest that confocal microscopy together with an averaging method may be a reasonable
alternative for relative site localisation.

Popular Abstract (Swedish)

I snart 500 år har människan använt sig av diverse optiska instrument för att betrakta sådant som inte är möjligt att se med blotta ögat. Teleskop har använts för att studera himlakroppar och mikroskop för att exempelvis undersöka små biologiska beståndsdelar.
Det finns idag många olika metoder inom optisk mikroskopi men samtliga följer en liknande
grundprincip. Objektet som ska avbildas exponeras för någon typ av energikälla (oftast laser-strålning), interagerar med den inkommande energin och avger därmed förändrad strålning som detekteras av en apparat.
Till följd av fysikens lagar finns det en specifik begränsning på hur god upplösning man kan lyckas få med ett konventionellt optiskt intrument. Denna så kallade diffraktions-begränsning beskrevs och myntades av Ernst Abbe år 1873 och har länge därefter betraktats som oöverkomlig. De bästa konventionella mikroskop kan idag nå en upplösning på cirka 300 nanometer (0.0000003 meter). Detta är inte tillräckligt för att exempelvis undersöka proteininteraktioner. De senaste åren har det dock dykt upp innovativa och fascinerande tekniker som lyckas överkomma diffraktionsbarriären. Dessa tekniker kallas kollektivt för super-resolutionstekniker och två av de vanligaste är STED och STORM.
I denna studie är vi intresserade av att avbilda bakterier för att förstå hur deras ytstrukturer interagerar med våra kroppar. Mer specifikt vill vi kunna besvara följande fråga: var binder bakterierna till våra kroppsegna molekyler och hur påverkar det deras chans att överleva och göra oss sjuka? Detta projekt ämnar att undersöka huruvida super-resolutionsteknikerna STORM och STED kan vara användbara i syfte att lokalisera bindningsplatser på bakterier.
STED systemet har en ringformad laser runt den vanliga lasern i ett mikroskop med syftet att, paradoxalt nog, minimera det inkommande ljusets utbredning. Man kan se det som att den ringformade lasern hämmar normal ljusinteraktion vid utkanterna av den vanliga lasern. STED har visats kunna uppnå en upplösning på 30-80 nanometer.
STORM systemet använder sig av ”blinkande” molekyler som objektet ifråga märks med. Genom mätning av tusentals blinkningar kan man matematiskt rekonstruera en resulterande bild med i teorin oändlig upplösning. Denna begränsas därför enbart av de blinkande molekylernas storlek, vilken ligger runt 20-30 nanometer.
Det finns flera praktiska för- och nackdelar med STORM och STED. Generellt kräver STED mer avancerad teknisk hantering medan STORM beror starkt på hur de biologiska proverna förbereds. Projektet har involverarat en hel del optimering genom många olika försök. I denna studie fick vi hög bildkvalite med STED. Detaljrikedomen var markant högre i STED-bilderna jämfört med diffraktionsbegränsade tekniker och STORM. Vi tror att avbildning med STORM kräver ytterliggare optimering av metod och analys.
Efter avbildning är det möjligt att använda bildhanteringstekniker för att framhäva detalj och information som vi även har testat. I detta projekt undersöktes dessutom en statistisk metod för att kunna kvantifiera resultaten på bästa sätt. STED bilderna, tilsammans med vår statistiska metod, möjliggjorde bestämning av en inbindningsplats med precision på 3.6 nanometer.

• author: Kumra, Vibha
• supervisor: Jason Beech; Pontus Nordenfelt; Jonas Tegenfeldt
• organization: Solid State Physics; Department of Physics
• course: FYSM30 20181
• year: 2018
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Physics and Astronomy
• keywords: super resolution imaging, STED, STORM, streptococcus pyogenes, M protein
• language: English
• id: 8947674
• date added to LUP: 2018-06-19 16:29:36
• date last changed: 2018-06-19 16:29:36