Advanced

Improving Hel11 scFv Antibody Production in Biomarker Discovery

Sturk, Kristina LU (2018) KIMM05 20181
Department of Immunotechnology
Abstract
Single chain fragment variable (scFv) antibodies from the library Hel11 are used in microarray applications for biomarker discovery. However, some scFv antibodies have been difficult to produce at sufficient yields and purity levels. In order to optimize the production of problematic scFv antibodies, three Hel11 scFv antibodies (PC244, PC253, and PC274) were chosen and the impact of the following conditions was studied: 1) the use of bacteria from a glycerol stock versus freshly transformed E. coli Top10, 2) if Top10 clones expressing the same scFv antibody differ in expression performance, and 2) if the use of E. coli expression strains BL21 and Rosetta could lead to an improvement. Findings of this study demonstrated a variation in... (More)
Single chain fragment variable (scFv) antibodies from the library Hel11 are used in microarray applications for biomarker discovery. However, some scFv antibodies have been difficult to produce at sufficient yields and purity levels. In order to optimize the production of problematic scFv antibodies, three Hel11 scFv antibodies (PC244, PC253, and PC274) were chosen and the impact of the following conditions was studied: 1) the use of bacteria from a glycerol stock versus freshly transformed E. coli Top10, 2) if Top10 clones expressing the same scFv antibody differ in expression performance, and 2) if the use of E. coli expression strains BL21 and Rosetta could lead to an improvement. Findings of this study demonstrated a variation in obtained yields and purities within the three different parts. None of the optimization options managed to produce scFv antibodies to mean concentrations that met the printing criterion and neither were the purities of samples with sufficient concentrations satisfactory. However, some of the investigated conditions showed more potential to improve the expression performance of the scFv antibodies that were a part of the study: producing PC244 in several glycerol stock Top10 clones, PC253 in freshly transformed Top10, and PC274 in glycerol stock Rosetta. The fact that different conditions were concluded to have the greatest potential for the three scFv antibodies covered in this study suggests that other problematic Hel11 scFv antibodies should be individually investigated when being optimized. (Less)
Popular Abstract
När en människa insjuknar i cancer förändras halterna av vissa molekyler i kroppen. Molekyler med denna egenskap kallas för biomarkörer och förändringen kan användas för att följa sjukdomsförloppet över tid, men också för att kunna ställa diagnos. Forskning har resulterat i att man för olika cancersorter har hittat en kombination av flera olika sorters biomarkörer som indikerar en viss cancertyp. Vanligast är att ett blodprov tas från patienten med misstänkt cancer. Därefter mäts provnivåerna av detta molekylära fingeravtryck och jämförs mot en cancerfri kontroll för att besvara frågan om huruvida cancertypen finns i kroppen.

Hur mäter man då nivån av flera biomarkörer på ett effektivt sätt? En metod med stor potential är plattformen... (More)
När en människa insjuknar i cancer förändras halterna av vissa molekyler i kroppen. Molekyler med denna egenskap kallas för biomarkörer och förändringen kan användas för att följa sjukdomsförloppet över tid, men också för att kunna ställa diagnos. Forskning har resulterat i att man för olika cancersorter har hittat en kombination av flera olika sorters biomarkörer som indikerar en viss cancertyp. Vanligast är att ett blodprov tas från patienten med misstänkt cancer. Därefter mäts provnivåerna av detta molekylära fingeravtryck och jämförs mot en cancerfri kontroll för att besvara frågan om huruvida cancertypen finns i kroppen.

Hur mäter man då nivån av flera biomarkörer på ett effektivt sätt? En metod med stor potential är plattformen IMMray™ som har utvecklats på Avdelningen för Immunteknologi vid Lunds Universitet. Plattformen utnyttjar antikroppar som är en naturlig del av det mänskliga immunförsvaret. I microarrayer används inte hela antikroppsmolekylen utan endast den del som kan binda till andra molekyler. Denna del kallas för single chain fragment variable (scFv). ScFv-fragmenten fästs i botten på ett chip och när provet adderas fångar respektive fragment den biomarkör som just det fragmentet kan binda till. Tack vare att plattformen är i ett småskaligt microarray-format krävs små mängder av både prov och antikroppsfragment. Innan provet man vill analysera adderas till chipet märks det med en fluorescerande tag som möjliggör att nivåerna av respektive biomarkör kan mätas.

Det har visat sig att några av scFv-fragmenten, som produceras i E. Coli-bakterier, har varit svåra att producera i tillräckliga mängder. Prover av dessa fragment har även visat sig innehålla för mycket orenheter.

I studien undersöks hur produktionen av antikroppsfragment kan optimeras. Undersökningen har skett genom att undersöka olika förändringars inverkan på proteinuttrycksprestandan – närmare bestämt mängden orenheter samt erhållen mängd av antikroppsfragment. Förändringarna som undersöktes var om det fanns någon skillnad i proteinuttryckspresetanda mellan E. coli-bakterier som varit nedfrysta vid -80°C och bakterier som inte varit nedfrysta innan produktionen, mellan olika bakterie-kopior som producerar samma antikroppsfragment samt mellan olika E. coli-bakteriestammar som producerar samma antikroppsfragment.

De olika optimeringsalternativen som utreddes i studien visade potential för förbättrad proteinuttrycksprestanda för de fragment som undersöktes i studien. Dock visade det sig att olika alternativ fungerade bäst för de olika fragment som utreddes i studien. Det innebär att det är svårt att ge en generell rekommendation för alla problematiska antikroppsfragment utifrån de erhållna resultaten. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Sturk, Kristina LU
supervisor
organization
course
KIMM05 20181
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
language
English
id
8949316
date added to LUP
2018-06-14 17:28:44
date last changed
2018-06-14 17:28:44
@misc{8949316,
  abstract     = {Single chain fragment variable (scFv) antibodies from the library Hel11 are used in microarray applications for biomarker discovery. However, some scFv antibodies have been difficult to produce at sufficient yields and purity levels. In order to optimize the production of problematic scFv antibodies, three Hel11 scFv antibodies (PC244, PC253, and PC274) were chosen and the impact of the following conditions was studied: 1) the use of bacteria from a glycerol stock versus freshly transformed E. coli Top10, 2) if Top10 clones expressing the same scFv antibody differ in expression performance, and 2) if the use of E. coli expression strains BL21 and Rosetta could lead to an improvement. Findings of this study demonstrated a variation in obtained yields and purities within the three different parts. None of the optimization options managed to produce scFv antibodies to mean concentrations that met the printing criterion and neither were the purities of samples with sufficient concentrations satisfactory. However, some of the investigated conditions showed more potential to improve the expression performance of the scFv antibodies that were a part of the study: producing PC244 in several glycerol stock Top10 clones, PC253 in freshly transformed Top10, and PC274 in glycerol stock Rosetta. The fact that different conditions were concluded to have the greatest potential for the three scFv antibodies covered in this study suggests that other problematic Hel11 scFv antibodies should be individually investigated when being optimized.},
  author       = {Sturk, Kristina},
  language     = {eng},
  note         = {Student Paper},
  title        = {Improving Hel11 scFv Antibody Production in Biomarker Discovery},
  year         = {2018},
}