Functional analysis of cultured retinal cells

Abstract

Worldwide, millions of people suffer from retinal degenerative diseases leading to cell death of light absorbing photoreceptors. This results in vision impairment and, in many cases, eventually blindness. A possible solution for patients gone legally blind due to retinal degeneration, is the use of retinal implants. The best performing retinal implants of today, regarding vision acuity, still give results beneath the limit of legal blindness. Material, biocompability and implant design need to be optimized. Nano scale structures are being suggested as promising in this area.
In this project, the aim was to establish a protocol to test the functionality of retinal cells grown on photovoltaic Indium Phosphide nanowires (InP NWs). This, to contribute to the knowledge of how nanostructures could be constructed in the development of future retinal implants. The idea with using these particular NWs is to have them act as artificial photoreceptors, capable of reacting to light coming into the eye, thereby electrically activating the cells in the retina that are in close contact with them.
Young wild type (wt) mouse retinal cells and retinal cells from adult rd1 mice with photoreceptor degeneration were dissociated and cultured on glass or on top of InP NWs. The function of the cells was investigated using live cell calcium imaging. Calcium is a key signaling ion and changes in calcium intracellular levels reflect neuronal activation. To evaluate cell survival and identify which cell types were present, immunohistochemistry was also performed.
The results showed that the developed protocol used supported cell survival for up to, at least, 16 days in vitro for wt cells. Cells cultured on glass could be seen to respond to chemical stimulation with K+. This could, however, not be shown for cells cultured on InP NWs, even though earlier immunohistochemistry studies have indicated that neuronal cells do survive well on these NWs. The confocal microscope setup used to perform the calcium analysis, was not optimal for imaging the cells grown on the NWs and may be the reason for the negative result. Some of the cells tested in the project, but not all, responded also to white light stimulation.
Overall, it was concluded that the developed protocol can be used to evaluate the functionality of retinal cells grown on glass, and to some extent cells grown on InP NWs. Further optimization is, however, necessary to satisfactorily investigate whether and how to excite retinal neuronal cells by stimulating the photovoltaic InP NWs.

Popular Abstract (Swedish)

Undersökning av näthinneceller odlade på ljuskänsliga nanotrådar

Människans sinnen bombarderas ständigt med nya intryck. En stor del av dessa förmedlas via vår syn. Ljus kommer in i ögat och absorberas av ljuskänsliga fotopigment som finns i de yttre segmenten av näthinnans fotoreceptorer. Näthinnan är uppbyggd av flera olika skikt och av flera olika celltyper, både nervceller och stödjande gliaceller. Människan har två typer av fotoreceptorer, dels de väldigt ljuskänsliga stavarna för att kunna se i dunkel belysning och dels tappar som ger oss synskärpa och färgseende.

Runt om i världen lider miljoner människor av retinala degenerativa sjukdomar, det vill säga sjukdomar där nervceller (fotoreceptorer) i ögats näthinna bryts ner av olika anledningar. De vanligaste sjukdomarna inom detta område är åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och Retinitis Pigmentosa (RP). I dagsläget finns ingen bot eller några effektiva behandlingar för dessa sjukdomar, även om intensiv forskning pågår på området. I takt med att sjukdomen progredierar försämras synen för den drabbade patienten och i många fall blir denne så gott som helt blind.
För patienter som förlorat synen på grund av AMD eller RP kan retinala implantat vara en framtida lösning. Implantat av detta slag finns redan idag, men synförbättringen som dessa medför når fortfarande inte över gränsen för vad som räknas som blindhet i lagens mening. Viss förbättring av att kunna urskilja mörkt/ljust och rörelse förekommer, men behovet av vidareutveckling av dessa produkter är stort. Dagens implantat är inte heller tillräckligt biokompatibla. Istället orsakar de mer eller mindre kroniska inflammationer och ärrbildning av nervvävnad, så att signaler till och från de implanterade elektroderna försvagas, eller till och med går helt förlorade.

Nanotrådar är små odlade strukturer på nanoskalan. Intensiv forskning på solcellsliknande nanotrådar av halvledarmaterial har visat att dessa verkar lovande vid utveckling av framtidens retinala implantat. Deras små dimensioner och potentiellt elektriskt ledande egenskaper gör dem till möjliga kandidater till att ersätta fotoreceptorer som gått förlorade. Genom att sända iväg en elektrisk signal som svar på inkommande ljus skulle dessa nanotrådar potentiellt kunna förbättra effektiviteten avsevärt hos implantaten och ge patienter en godtagbar synförmåga tillbaka.
Det övergripande målet för detta projekt har varit att bidra till kunskap om hur ljuskänsliga nanotrådar kan stimulera celler i ögats näthinna. Mer specifikt så har ett protokoll utvecklats för att testa cellers funktion efter att de odlats på nanotrådar av indiumfosfid (InP).

Näthinneceller från möss från två olika stammar användes vid försöken, dels från 4–5 dagar gamla möss med friska näthinnor och dels från vuxna möss med degenerativ ögonsjukdom liknande RP. Cellerna odlades till att börja med på glas, men sedan även på nanotrådar av InP. Dessa undersöktes därefter med hjälp av calcium imaging för att se cellernas respons på olika kemiska stimulerande substanser och ljus. Även immunohistokemi användes för att avgöra vilka celltyper som fanns bland de undersökta cellerna.

Vad gäller överlevnaden för cellerna i experimenten visade tester att celler viktiga för att kunna optimera framtida implantat överlevde åtminstone 16 dagar efter att djuren avlivats. Det visade sig även att celler från båda stammarna odlade på glas reagerade vid tillförsel av kalium. Detta gällde dock inte när cellerna odlats på nanotrådar av InP. Att så inte var fallet skulle kunna bero på brister i protokollet. En del av experimenten visade även respons från celler som stimulerades med vitt ljus. Vidare optimering av protokollet är dock nödvändig för att resultaten ska kunna ses som mer konsekventa.

• author: Olsson, Therese
• supervisor: Maria Thereza Perez
• organization: Department of Biomedical Engineering
• course: BMEM01 20181
• year: 2018
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering
• keywords: InP, nanowires, retina, retinal degeneration, RP, AMD, calcium imaging, glia, eye, neuronal, protocol, functional analysis, implants, rd1, wild type, immunohistochemistry, cell culturing, photovoltaic, chemical stimulation, ophthalmology, biomedical engineering, nanoscience
• language: English
• additional info: 2018-14
• id: 8952444
• date added to LUP: 2018-06-26 13:33:34
• date last changed: 2018-06-26 13:33:34