Production of liposomes and their interaction with the complement system

Abstract

Liposomes are closed spherical bilayered membrane structures in aqueous solutions, with an internal aqueous compartment entrapped by either a single or multiple concentric lipid bilayer(s). They can be used as a tool in research to mimic simple cell membranes, to study e.g. lipid-protein interactions, as well as they are extensively used as carriers of various molecules, especially for tumor targeted administration of cytotoxic drugs with a narrow therapeutic index. In this project we have investigate five liposome purification techniques, including; dialysis, dialysis followed by membrane incubation in Spectra gel®, centrifugal ultrafiltration, ultracentrifugation, and centrifugation, to determine how these purification methods impact liposome integrity, considering size, polydispersity index (PDI), and ζ-potential, and lipid recovery.

The thin-film hydration method followed by hand extrusion was used to prepare negatively charged liposomes whereas dynamic light scattering, and a phospholipid assay kit was used to determine effect on liposome integrity and percent of lipid recovery pre- and post-isolation, respectively. In depth analysis of C3 binding to liposomal surfaces and a following C3 convertase formation together with complement factors B, D, and P, was studied using dot blotting and Wes. Liposomal complement activation was studied in human whole blood using an ex vivo Chandler loop model followed by analysis using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

No impact on liposome size, PDI, and ζ-potential post purification was observed following dialysis, dialysis followed by membrane incubation in Spectra gel®, centrifugal ultrafiltration. Liposome size and charge were affected by ultracentrifugation, whereas centrifugation impacted the and size and PDI of liposomes. Dialysis was the only purification method which did not significantly affect the lipid recovery. However, centrifugation was chosen as the preferred method of purification due to its simplicity, time efficiency, and relatively high lipid recovery.

It was confirmed using dot blot that C3 binds to large negative liposomes, however only a small fraction of the bound C3 was in an active C3 confirmation. The C3 concentration on the liposomal surface could not be quantified using Wes. C3 and C3(H2O) formed active fluid phase C3 convertases together with factor B and factor D in a pure system, however, no formation of an active C3 convertase was observed on the surface on large negatively charged liposomes. Negative liposomes added to human whole blood significantly increased the generation of C3a, whereas the generation of sC5b-9 was comparable with the negative control (PBS), thus indicating that negative liposomes induce the complement system in human whole blood, while avoiding inducing downstream inflammatory responses.

Popular Abstract (Swedish)

Det naturliga immunförsvarets attack mot liposomer

Liposomer är små konstgjorda vesiklar som är uppbyggda av samma byggstenar som biologiska cellmembran. Liposomer kan användas för att transportera olika typer av molekyler i kroppen, exempelvis läkemedel. De kan även användas inom forskning som en modell över ett enkelt cellmembran för att ge en uppfattning om hur mer komplexa biologiska system kan fungera.

Liposomer är uppbyggda av lipider vilka har en vattenälskande del och en vattenhatande del. När lipiderna exponeras för vatten interagerar de vattenälskande delarna med vattenfasen och de vattenhatande delarna interagerar med varandra. Vilket skapar ett sfäriskt dubbellager av lipider som omsluter en kärna av vatten. Detta medför att liposomer kan kapsla in vattenlösliga ämnen i den omslutna vattenfasen, medan fettlösliga ämnen kan föras in bland de vattenhatande delarna i dubbellagret av lipidmolekylerna. Därav är kan liposomer skydda känsliga molekyler från att direkt brytas ner av kroppens immunförsvar. Även om liposomer anses ha stor potential som läkemedelssystem kvarstår ett antal problem i produktionen av funktionella liposomer, bland annat att rena upp liposomer från fria kontaminerande molekyler. Ett annat problem är att oskyddade liposomer snabbt känns igen av det naturliga immunförsvaret, speciellt av komplement systemet, vilket leder till att liposomerna och deras last snabbt bryts ner. Dock är det fortfarande okänt genom vilken mekanism liposomerna aktiverar immunförsvaret. En teori är att när liposomer kommer i kontakt med komplementproteinet C3, vilket är ett centralt protein i aktiveringen av komplementsystemet och det naturliga immunförsvaret, leder det till att C3 formförändras till en aktiv molekyl, C3(H2O), vilken kan starta en immunattack mot liposomerna.

Syftet med det här projektet var dels att undersöka om liposomernas storlek, storleksdistrubition, laddning, och koncentration påverkades efter rening genom dialys, dialys följt av inkubering av membranet i en superabsorbent, centrifugal ultrafiltrering, ultracentrifugering, och centrifugering. Resultaten visade att liposomernas storlek, storleksdistrubition, och laddning inte påverkades efter dialys, dialys följt av inkubering av membranen i en superabsorbent eller centrifugal ultrafiltrering. Däremot påverkades liposomernas storlek och laddning av ultracentrifugering, och centrifugering ändrade liposomernas storlek och storleksdistrubition. Dialys var den enda av de fem metoderna som inte påverkade koncentrationen av liposomerna. Studien visar att val av metod för att rena upp liposomer har stor betydelse för liposomernas egenskaper och koncentration, vilket är viktigt att ta reda på, då förändringar kan bidra till att liposomernas applicerbarhet som exempelvis läkemedelbärare förändras till det sämre.

Vi undersökte även om C3 binder till ytan av negativt laddade liposomer, vilket påvisades genom dot blotting, där resultatet även indikerade att endast en liten del av det C3 som är bundet till ytan var i en aktiv form. Ingen aktivitet observerades för C3 bundet till ytan av liposomer med hjälp av Wes. Däremot aktiverade negativt laddade liposomer komplement systemet i humant blod, vilket konstaterades med hjälp av enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA). Genom att använda liposomer som en modell över ett cellmembran kan förståelsen om hur C3 interagerar med lipidytor öka, vilket dels är viktigt för att kartlägga C3s funktion i kroppen, men även för att förstå hur liposomer attackeras av kroppens immunförsvar. Detta för att i framtiden kunna förbättra strategierna för att skydda exempelvis läkemedelsbärande liposomer från att snabbt brytas ner.

Master uppsats i molekylärbiologi, 60 hp, 2018
Biologiska institutionen, Lunds Universitet

Handledare: Claudia Dürhkop and Kristina Nilsson-Ekdahl
Institutionen för Klinisk Immunologi, Uppsala Universitet

• author: Adler, Anna
• supervisor: Kristina Nilsson Ekdahl; Karin Fromell
• organization: Degree Projects in Molecular Biology
• course: MOBN03 20172
• year: 2018
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 8952608
• date added to LUP: 2018-06-25 09:47:52
• date last changed: 2018-06-25 09:47:52