CRISPR/Cas9 gene-editing in an in vitro model of a familial form of ALS

Abstract

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neuromuscular disease characterized by the degeneration and death of both upper and lower motor neurons for which there is no cure currently available. The degeneration of motor neurons leads to the inability to carry out voluntary movement and death usually occurs 3-5 years after disease onset by respiratory failure. The most common cause of familial ALS is associated with mutations in the superoxide dismutase gene (SOD1). The SOD1 gene codes for an enzyme that is ubiquitously expressed and is involved in neutralizing reactive oxygen species. Mutations in the SOD1 gene lead to a toxic gain-of-function and astrocytes with mutated SOD1 has been shown to kill motor neurons by releasing toxic factors. In this project the gene-editing tool CRISPR/Cas9 was used to knock down SOD1 in forebrain neural progenitor cells (FB NPCs) using single guide RNAs (sgRNAs) to target the SOD1 gene specifically. The embryonic stem cell line RC17 and the induced pluripotent and patient-specific stem cell line SOD1L144P were differentiated to forebrain neural progenitor cells (FB NPCs) using a 16-day protocol. Lentivirus vectors were used to deliver the Cas9 protein, a sgRNA targeting either exon 2 (sgRNA:E2) or exon 3 (sgRNA:E3) and the green-fluorescent protein (GFP) as a reporter gene into the cells. The success of the differentiation was validated based on immunocytochemistry staining for the expression of FOXG1 and nestin, and the transduction on the presence of GFP. Staining for SOD1 was carried out to study the SOD1 knock-down on a protein level. The knock-down of SOD1 was also analysed based on mRNA expression using qPCR with a SOD1-specific primer. The results from the qPCR showed that the cells transduced with sgRNA:E2 and sgRNA:E3 had a reduced expression of SOD1 in both cell lines. In the case of sgRNA:E3 the reduction was more than four-fold in both cell lines.

Popular Abstract (Swedish)

Under projektets gång användes gen-editeringsmetoden CRISPR/Cas9 för att förhindra uttrycket av en gen som är associerad med en familjär form av ALS i två stamcellslinjer som hade blivit differentierade till hjärnceller. Genom genuttrycksanalys visades att CRISPR/Cas9 hade lyckats orsaka en fyrfaldig minskning av SOD1-uttryck i båda cellinjer.
Amyotrofisk lateralskleros, förkortat ALS är en neuromuskulär sjukdom som kännetecknas av degenerationen av motor neuroner, vilka är nödvändiga för att utföra kontrollerbara rörelser. De primära symptomen för ALS är muskelatrofi, muskelsvaghet, muskelkramp samt tal-och sväljsvårigheter, och inträffar oftast mellan åldrarna 55 och 75 år. Det finns inget botemedel mot ALS och död inträffar vanligtvis 3–5 år efter de första symptomen genom andningssvikt. Ungefär 3 personer per 100 000 per år utvecklar ALS och orsaken kan både vara familjär (genetisk) eller sporadisk. Cirka 10% av alla fall är familjära där patienterna har en genetisk predisposition att utveckla sjukdomen. De vanligaste fallen av ALS är associerade med mutationer i superoxide dismutase (SOD1) genen. Även om den exakta mekanismen bakom patologin är inte fullt förstådd så tyder mycket på att det bildas proteinaggregat av SOD1 som är toxiska för cellerna.
Många försök har gjorts att knocka ner uttrycket av SOD1, men dessvärre har resultaten inte varit kliniskt signifikanta. Dessutom har dessa försök inte lett till permanenta förändringar i genen utan endast minskat uttrycket av SOD1 för stunden. Genom att använda gen-editeringsmetoden CRISPR/Cas9 kan ändringar i SOD1-genen göras på en DNA-nivå vilket skulle leda till permanenta förändringar i arvsmassan. CRISPR/Cas9 består av två komponenter; ett protein som kallas Cas9 och är ett enzym som kan klippa i DNA molekyler and en guide-molekyl som leder Cas9 till rätt plats i genomet där det sen klipper. När en cell försöker reparera skadan från Cas9 introducerar reparationssystemet fel i genen, vilket leder till att den inte uttrycks. Den andra komponenten är en guide-molekyl och ansvarar för var i genomet Cas9 ska klippa. Med komplementär DNA-basparning kommer guiden att binda in i genomet och aktivera Cas9. Genom att designa guides som har endast komplementaritet med SOD1 genen i hela genomet kommer den guiden att leda Cas9 dit som i sin tur kommer att klippa där och förhindra proteinuttrycket. Två guide-molekyler som riktade sig mot SOD1 genen köptes in och introducerades tillsammans med Cas9 i hjärnceller som hade differentierats från stamceller med hjälp av ett 16-dagarsprotokoll. Två stycken stamcellslinjer användes (RC17 och patient-specifika SOD1L144P).
Att differentieringen från stamceller till hjärnceller hade lyckats validerades med att studera proteinerna FOXG1 och nestin, som uttrycks av hjärncellerna men inte av stamcellerna. Dessutom analyserades SOD1-proteinet för att identifiera en potentiell minskning i proteinuttryck. Celler med guide och Cas9 separerades från celler utan guide och Cas9 för att kunna jämföra uttrycket av SOD1 mellan de två populationerna. Cellernas SOD1-uttryck analyserades och resultaten visade att CRISPR/Cas9 hade lyckats att minska uttrycket av SOD1 i båda cellinjerna, och en guide hade till och med lyckats medföra en fyrfaldig minskning i båda cellinjer.

• author: Nilsson, Fredrik
• supervisor: Olof Torper
• organization: Pure and Applied Biochemistry; Computational Chemistry
• course: KBKM05 20181
• year: 2018
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Biology and Life Sciences
• keywords: ALS, SOD1, Amyotrophic lateral sclerosis, superoxide dismutase, CRISPR/Cas9, sgRNA, stem cell, lentivirus, qPCR, FOXG1, nestin, immunocytochemistry, differentiation, forebrain neural progenitor, Applied Biochemistry
• language: English
• id: 8953137
• date added to LUP: 2022-06-30 10:21:09
• date last changed: 2022-06-30 10:21:09