From which reductase does the Mg-protoporphyrin IX monomethyl ester cyclase acquire its electrons?

Popular Abstract (Swedish)

Vem ger elektroner till cyklaset?

Alla organismer som utför fotosyntes är beroende av klorofyll. Utåt sett ger klorofyllet växter sin gröna färg men inuti är det kraftverket som fångar in energi från solljus. Fotonerna fångas upp i klorofyllets antennsystem och dess elektron förs vidare in mot mitten där reaktionscentret finns. Därifrån förs elektronerna vidare till elektrontransportkedjan där energin omvandlas ATP, vilket kan ses som valutan organismen måste betala för att utföra vissa kemiska processer. Klorofyllmolekylen består av en magnesiumjon i mitten, omringad av fyra pyrrolringar. Molekylen har även en femte ring, fäst på utsidan av en av de fyra ringarna och det är produktionen av denna som fortfarande inte är helt förstådd ännu och är det vi har jobbat med. Produktionen av den femte ringen får hjälp av enzymet cyklas, vilket hjälper till med påskyndandet av den kemiska reaktionen. För att cyklaset ska fungera måste den få tillgång till elektroner och vi har försökt ta reda på vilket protein hos korn som tar upp elektroner från fotosyntesen och ger den till cyklaset.

Vi använde oss av cyklas assays, där man med hjälp av ljus, kan se hur mycket klorofyll som har bildats. Genom att tillföra proteiner som redan finns i fotosyntesen men därigenom öka mängden av dessa proteiner och förhoppningsvis se en ökad produktion av klorofyll. Vi har även tillsatt antikroppar som binder till ferredoxin, vilket är ett protein i fotosyntesen. När antikropparna binder till ferredoxinet så hämmas den och kan inte utföra sin uppgift. Om det är ferredoxinet som ger elektroner till cyklaset bör det ses en minskning i produktionen av klorofyll.

Vi har även använt oss av western blot där man tillsätter primära antikroppar som binder till specifika proteiner. Sekundära antikroppar tillsätts som binder in till de primära, en reaktion kommer att ske vilket gör att det går att se vilka proteiner som finns närvarande. För detta använde vi olika mutanter av korn som har olika defekter i sin klorofyllproduktion för att på så sätt se om några av de testade proteinerna saknades i dessa mutanter.

Vi testade att via Agroinfiltration tillföra en ferredoxingen till en mutant som inte kan producera klorofyll på grund av avsaknad av just denna gen. Vi började med att överföra genen in i bakterien Agrobacterium, som är känd för att kunna ta sig in i växter och sedan uttrycka sina gener i växten. Med hjälp av en spruta tryckte vi in bakterien i gula blad för att se om uttryck av genen startade klorofyllproduktionen och bladen därmed blev gröna. Vi infiltrerade även i gröna blad för att ha som kontroller.

Vi kom fram till att öka antal proteiner minskade klorofyllproduktionen. Vi hade behövt mer tid att få fram rena proteiner då vi tyvärr inte hade lyckats helt med framställningen av dem. Genom att inhibera ferredoxin med antikroppar så minskade produktionen av klorofyll. Vilket kan betyda att det är ferredoxin som ger elektroner till cyklaset, men mer tester måste göras innan vi kan vara säkra. Vår western blot gav tyvärr inte så klara resultat då antikropparna band in till fler proteiner än vi hade tänkt oss. Detta kan bero på att proteinerna vi sökte inte fanns där, eller att framtagningen av proteinerna inte gick helt rätt till. Infiltreringen av Agrobacterium gav inte heller önskat resultat då inget hände med de gula bladen. Däremot blev de gröna bladen gula vid infiltrationen. Detta kan bero på att genen blev överuttryckt vilket kan leda till att genen istället stängs av, vilket medför att klorofyll slutar tillverkas och växten blir gul. Slutsatsen av dessa experiment är att ferredoxin verkar vara den som har störst påverkan på klorofyllproduktionen och därmed kanske är den som ger elektroner till cyklaset.

Examensarbete för kandidatexamen i Molekylär Biologi 15 hp 2018 Biologiska institutionen, Lunds Universitet
Handledare: Mats Hansson och David Stuart
Molekylär cellbiologi

• author: Sandström, Malin
• supervisor: Mats Hansson; David Stuart
• organization: Degree Projects in Molecular Biology
• course: MOBK01 20181
• year: 2018
• type: M2 - Bachelor Degree
• subject: Biology and Life Sciences
• language: English
• id: 8962631
• date added to LUP: 2018-10-30 15:00:37
• date last changed: 2018-10-30 15:00:37