The crucial combination of DNA polymerase, qPCR assay and background matrix
(2018) MOBN03 20181Degree Projects in Molecular Biology
- Abstract
- Quantitative PCR (qPCR) is a commonly used method today in the fields of molecular diagnostics, forensic and food analysis. The real-time measurements of amplification and quantification of specific DNA molecules is one of many reasons why qPCR is the method of choice. However, presence of inhibitory compounds limit this method for example by interacting with either the DNA polymerase or the DNA template, increasing the errors and impairing the detection limit. This is why pre-PCR processing, where the effect of inhibitory compounds are handled prior to qPCR amplification, is of importance. A well-designed robust qPCR assay is essential to obtain reliable results. However, the choice of DNA polymerase also plays a significant role since... (More)
- Quantitative PCR (qPCR) is a commonly used method today in the fields of molecular diagnostics, forensic and food analysis. The real-time measurements of amplification and quantification of specific DNA molecules is one of many reasons why qPCR is the method of choice. However, presence of inhibitory compounds limit this method for example by interacting with either the DNA polymerase or the DNA template, increasing the errors and impairing the detection limit. This is why pre-PCR processing, where the effect of inhibitory compounds are handled prior to qPCR amplification, is of importance. A well-designed robust qPCR assay is essential to obtain reliable results. However, the choice of DNA polymerase also plays a significant role since different DNA polymerases are more or less tolerant to different types of inhibitors. The aims of this project were to study the amplification efficiency and detection limit when combining DNA polymerases with different qPCR assays. Moreover, the performance of the DNA polymerases with qPCR assays was also studied when more or less inhibitory matrices were added. Lastly, due to several parameters affecting the qPCR, a method with the purpose of determining the extension rate assay of the DNA polymerase was set up in the lab. The results showed that the performance of DNA polymerases varied depending on both qPCR assay and matrix. Moreover, the prominence of a robust qPCR assay was clearly observed. The results from the enzymatic rate assay indicated that performance of one DNA polymerase was decreased when inhibitory matrices were added, while the performance of another DNA polymerase on the contrary increased. However, further investigations are needed to elucidate the mechanisms behind this. (Less)
- Popular Abstract (Swedish)
- DNA, som nålen i en höstack – vem hittar den först?
Inom diagnostiska och forensiska analyser är det viktigt att material undersöks med en metod som är tillförlitlig och som dessutom klarar av att analysera små mängder av materialet. Oavsett om kriminaltekniker hittar blod på en brottsplats, om livsmedlet innehåller smittsamma virus, eller om husdjuret får en allvarlig bakterieinfektion, analyseras prover ofta för förekomsten av DNA. Genom att bestämma hur DNA:t ser ut, är det möjligt att identifiera en mänsklig individ eller en bakterie- eller virustyp. Var det gärningsmannens blod på brottsplatsen, hittades höga mängder virus i livsmedlet, eller vilken typ av bakterie har infekterat husdjuret? Detta är viktiga frågor med svar som... (More) - DNA, som nålen i en höstack – vem hittar den först?
Inom diagnostiska och forensiska analyser är det viktigt att material undersöks med en metod som är tillförlitlig och som dessutom klarar av att analysera små mängder av materialet. Oavsett om kriminaltekniker hittar blod på en brottsplats, om livsmedlet innehåller smittsamma virus, eller om husdjuret får en allvarlig bakterieinfektion, analyseras prover ofta för förekomsten av DNA. Genom att bestämma hur DNA:t ser ut, är det möjligt att identifiera en mänsklig individ eller en bakterie- eller virustyp. Var det gärningsmannens blod på brottsplatsen, hittades höga mängder virus i livsmedlet, eller vilken typ av bakterie har infekterat husdjuret? Detta är viktiga frågor med svar som kräver noggrannhet. Oftast förekommer små mängder av DNA i det material som ska analyseras, och då krävs det en metod med hög känslighet. Målet med mitt arbete var att utreda skillnader och likheter mellan olika komponenter som används för DNA-analys, i syfte att förbättra metoden till att ge ännu mer pålitliga, precisa och snabba resultat. Detta kommer förhoppningsvis leda till att ännu mindre mängd material kan analyseras med precist svar i framtiden.
En av de viktigaste komponenterna i DNA-analys är DNA-polymeraset, ett enzym som gör så att utvalda delar av DNA:t i materialet (exempelvis i blodet) kopieras till många kopior. Denna mängd kan senare analyseras och ge svar på om det var gärningsmannens DNA på brottsplatsen eller inte. Om blodet från den misstänkta gärningsmannen hittades i jord, förekommer väldigt mycket smuts i provet, men ofta små mängder mänskligt DNA. DNA-polymeraset har då, tillsammans med små DNA-bitar som kallas primrar, den avgörande uppgiften att hitta nålen i höstacken, eller i detta fall hitta de utvalda delarna av mänskligt DNA, för att sedan starta kopieringen så att DNA-profilen kan analyseras. Det har tidigare visats att olika DNA-polymeras fungerar olika bra beroende på vilken typ av smuts som finns i materialet. Vissa DNA-polymeras fungerar bättre för att kopiera DNA från blod, medan andra kopierar DNA från jord betydligt bättre. Min uppgift var att studera hur olika kombinationer av DNA-polymeras och DNA-bitar (primrar) fungerar för att hitta DNA från olika organismer, både med och utan smuts (exempelvis blod). Resultaten visade på att DNA-polymerasens prestation varierade beroende på vilken organisms DNA de kopierade. DNA-polymerasens prestation varierade också beroende på vilken smuts som tillsattes till provet, och även med vilka primrar som användes. Slutsatsen för denna metod är då att det är väldigt viktigt att tänka på vilket DNA-polymeras vi väljer, då de fungerar olika bra beroende på vilka primrar som används och vilken typ av smuts som finns i provet.
En ny metod, med målet att bestämma hur fort DNA-polymeraset kopierar upp DNA:t, sattes även upp på labbet. Genom att bestämma hur hastigheten påverkas av olika typer smuts för de olika DNA-polymerasen, är det möjligt att få djupare kunskap om vilka DNA-polymeras som presterar bäst i olika sammanhang. Resultaten visade på att vissa DNA-polymeras inte klarar av att hantera smuts i proven, medan andra DNA-polymeras fungerar bättre med smuts i proven än utan. Detta kan då kopplas till resultaten av förra metoden där vissa DNA-polymeras inte alls fungerade utan smuts, men när smuts kom med i proverna fungerade dem. Mer forskning inom DNA-polymerasens hastighet behöver göras då tidsbrist på arbetet tyvärr begränsade denna studie.
Handledare: Linda Jansson och Maja Sidstedt (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/8963468
- author
- Johansson, Felicia
- supervisor
-
- Maja Sidstedt LU
- Linda Jansson LU
- organization
- course
- MOBN03 20181
- year
- 2018
- type
- H2 - Master's Degree (Two Years)
- subject
- language
- English
- id
- 8963468
- date added to LUP
- 2018-11-26 14:39:13
- date last changed
- 2018-11-26 14:39:13
@misc{8963468,
abstract = {{Quantitative PCR (qPCR) is a commonly used method today in the fields of molecular diagnostics, forensic and food analysis. The real-time measurements of amplification and quantification of specific DNA molecules is one of many reasons why qPCR is the method of choice. However, presence of inhibitory compounds limit this method for example by interacting with either the DNA polymerase or the DNA template, increasing the errors and impairing the detection limit. This is why pre-PCR processing, where the effect of inhibitory compounds are handled prior to qPCR amplification, is of importance. A well-designed robust qPCR assay is essential to obtain reliable results. However, the choice of DNA polymerase also plays a significant role since different DNA polymerases are more or less tolerant to different types of inhibitors. The aims of this project were to study the amplification efficiency and detection limit when combining DNA polymerases with different qPCR assays. Moreover, the performance of the DNA polymerases with qPCR assays was also studied when more or less inhibitory matrices were added. Lastly, due to several parameters affecting the qPCR, a method with the purpose of determining the extension rate assay of the DNA polymerase was set up in the lab. The results showed that the performance of DNA polymerases varied depending on both qPCR assay and matrix. Moreover, the prominence of a robust qPCR assay was clearly observed. The results from the enzymatic rate assay indicated that performance of one DNA polymerase was decreased when inhibitory matrices were added, while the performance of another DNA polymerase on the contrary increased. However, further investigations are needed to elucidate the mechanisms behind this.}},
author = {{Johansson, Felicia}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{The crucial combination of DNA polymerase, qPCR assay and background matrix}},
year = {{2018}},
}